应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上
272/3返回列表上一页123下一页
查看: 5857  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
高保真酶末端不加A的，当然连不上,可以加A后连，效率不高还麻烦，换各公司-B(blunt)系列载体，有些国产公司都出topo克隆了，连接十分钟就可以转化，效果挺好。
赞一下(1人) 回复此楼
生命不息，探索不止。
11楼2011-12-01 21:53:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangtianyuan

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
最简单的就是用pEASY-Blunt 克隆载体就行了。
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2011-12-01 23:28:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huangfaping

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
加A后才能进行T克隆
赞一下(1人) 回复此楼
13楼2011-12-02 11:37:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

念碎碎

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
高保真酶扩增的没有A尾巴
赞一下(1人) 回复此楼
14楼2011-12-03 09:41:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tztboy

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是不是可以这样：纯化回收，用相同的可以切出粘性末端的酶来酶切载体和目的片段，电泳后再回收，在用连接酶连接，之后转化涂板？我实验室就是这样子做的，成功率高，无杂菌
赞一下 回复此楼
15楼2012-05-31 10:38:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuzoda

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
其实高保真加A很简单，只需在PCR之后的体系中加入普通的Taq酶，72度保温20min就可以了
赞一下 回复此楼
16楼2012-07-11 20:44:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼上都是正解，一般高保真酶是不加ployA的，所以肯定连不上T载体了哈，先加上A，再连，还是很好练的，或者你可以考虑直接用LA，因为那个也是扩出来有A的
赞一下 回复此楼
17楼2012-11-28 15:11:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

生物生物

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by madengyu at 2011-12-01 15:27:54
高保真酶P出来，一般是平末端是不含有A尾的。你首先看看你的高保真酶的说明，看看是否可以进行TA克隆（普通Taq酶P出来一般是粘性末端，可以直接TA克隆）。如果不能直接进行，还需要加A，再进行TA克隆；或者用平末端 ...

做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上2分钟导入感受态DH5a摇床培养1小时后，在含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单菌落，挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时，用菌液PCR检测（所用引物于前面pcr的引物相同，反映条件也相同，只是94度预变性时间改为10分钟）。但是检测结果没有目的条带，只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您，这是什么原因？
赞一下 回复此楼
18楼2013-03-27 13:35:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

生物生物

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by vickie20 at 2011-12-01 14:21:52
无法回答……你给的信息好少……

做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上2分钟导入感受态DH5a摇床培养1小时后，在含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单菌落，挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时，用菌液PCR检测（所用引物于前面pcr的引物相同，反映条件也相同，只是94度预变性时间改为10分钟）。但是检测结果没有目的条带，只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您，这是什么原因？
赞一下 回复此楼
19楼2013-03-27 13:35:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

生物生物

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by piaoyunokok at 2011-12-01 19:36:22
高保真酶扩增的没有A尾巴，不能直接链T载体滴，

做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上2分钟导入感受态DH5a摇床培养1小时后，在含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单菌落，挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时，用菌液PCR检测（所用引物于前面pcr的引物相同，反映条件也相同，只是94度预变性时间改为10分钟）。但是检测结果没有目的条带，只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您，这是什么原因？
赞一下 回复此楼
20楼2013-03-27 13:36:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 木马。 的主题更新
272/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 机械专硕273请求调剂 +6 庚申壬申 2026-04-07 6/300 2026-04-08 22:41 by bljnqdcc
[考研] 302分求调剂 +4 凡语祈愿 2026-04-08 5/250 2026-04-08 22:03 by 土木硕士招生
[考研] 本科211，293分请求调剂 +12 莲菜就是藕吧 2026-04-03 13/650 2026-04-08 20:30 by 背对大海出发
[考研] 一志愿吉大化学327求调剂 +12 王王白石 2026-04-06 13/650 2026-04-08 16:05 by luoyongfeng
[考研] 材料调剂 +12 一样YWY 2026-04-02 14/700 2026-04-07 12:52 by Sammy2
[考研] 295求调剂 +18 xndjjj 2026-04-04 19/950 2026-04-07 11:02 by wangjy2002
[考研] 考研调剂 +3 Wwwwwww哇 2026-04-06 3/150 2026-04-06 20:55 by lbsjt
[考研] 285求调剂 +5 mapmath 2026-04-06 6/300 2026-04-06 17:18 by 蓝云思雨
[考研] 315求调剂 +5 ＆123456789 2026-04-05 5/250 2026-04-05 19:55 by nepu_uu
[考研] 296求调剂 +3 汪！？！ 2026-04-05 5/250 2026-04-05 17:38 by 蓝云思雨
[考研] 311分 22408 求调剂 +3 bing_bot 2026-04-03 3/150 2026-04-05 00:43 by chongya
[考研] 一志愿郑大0705求调剂 +3 橘十一 2026-04-02 4/200 2026-04-05 00:05 by chongya
[考研] 278求调剂 +14 范婷娜 2026-04-04 15/750 2026-04-04 22:15 by lqwchd
[考研] 一志愿北交大材料工程总分358 +6 cs0106 2026-04-03 6/300 2026-04-04 11:20 by w_xuqing
[考研] 322求调剂 +4 FZAC123 2026-04-03 4/200 2026-04-03 20:55 by zhq0425
[考研] 071000生物学调剂 +8 知昭蔓 2026-04-02 8/400 2026-04-03 10:36 by macy2011
[考研] 312求调剂 +6 小小墨123 2026-04-02 7/350 2026-04-03 07:32 by jsw79
[考研] 一志愿山东大学，085600，344 +7 魏子per 2026-04-02 8/400 2026-04-02 21:12 by 百灵童888
[考研] 一志愿北京科技材料科学与工程288分，求调剂 +14 是辰啊 2026-04-02 14/700 2026-04-02 21:10 by dongzh2009
[考研] 285求调剂 +8 AZMK 2026-04-02 11/550 2026-04-02 20:16 by yulian1987
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭