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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
高保真酶末端不加A的，当然连不上,可以加A后连，效率不高还麻烦，换各公司-B(blunt)系列载体，有些国产公司都出topo克隆了，连接十分钟就可以转化，效果挺好。
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生命不息，探索不止。
11楼2011-12-01 21:53:02
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yangtianyuan

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
最简单的就是用pEASY-Blunt 克隆载体就行了。
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12楼2011-12-01 23:28:30
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huangfaping

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
加A后才能进行T克隆
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13楼2011-12-02 11:37:22
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念碎碎

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
高保真酶扩增的没有A尾巴
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14楼2011-12-03 09:41:44
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tztboy

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是不是可以这样：纯化回收，用相同的可以切出粘性末端的酶来酶切载体和目的片段，电泳后再回收，在用连接酶连接，之后转化涂板？我实验室就是这样子做的，成功率高，无杂菌
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15楼2012-05-31 10:38:51
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xuzoda

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
其实高保真加A很简单，只需在PCR之后的体系中加入普通的Taq酶，72度保温20min就可以了
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16楼2012-07-11 20:44:58
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼上都是正解，一般高保真酶是不加ployA的，所以肯定连不上T载体了哈，先加上A，再连，还是很好练的，或者你可以考虑直接用LA，因为那个也是扩出来有A的
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17楼2012-11-28 15:11:45
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生物生物

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by madengyu at 2011-12-01 15:27:54
高保真酶P出来，一般是平末端是不含有A尾的。你首先看看你的高保真酶的说明，看看是否可以进行TA克隆（普通Taq酶P出来一般是粘性末端，可以直接TA克隆）。如果不能直接进行，还需要加A，再进行TA克隆；或者用平末端 ...

做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上2分钟导入感受态DH5a摇床培养1小时后，在含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单菌落，挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时，用菌液PCR检测（所用引物于前面pcr的引物相同，反映条件也相同，只是94度预变性时间改为10分钟）。但是检测结果没有目的条带，只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您，这是什么原因？
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18楼2013-03-27 13:35:26
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生物生物

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by vickie20 at 2011-12-01 14:21:52
无法回答……你给的信息好少……

做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上2分钟导入感受态DH5a摇床培养1小时后，在含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单菌落，挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时，用菌液PCR检测（所用引物于前面pcr的引物相同，反映条件也相同，只是94度预变性时间改为10分钟）。但是检测结果没有目的条带，只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您，这是什么原因？
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19楼2013-03-27 13:35:39
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生物生物

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by piaoyunokok at 2011-12-01 19:36:22
高保真酶扩增的没有A尾巴，不能直接链T载体滴，

做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上2分钟导入感受态DH5a摇床培养1小时后，在含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单菌落，挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时，用菌液PCR检测（所用引物于前面pcr的引物相同，反映条件也相同，只是94度预变性时间改为10分钟）。但是检测结果没有目的条带，只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您，这是什么原因？
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20楼2013-03-27 13:36:13
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