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木马。

新虫 (初入文坛)

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[交流] 高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上已有19人参与

高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上。求指点。。

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1楼2011-12-01 14:19:31

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生物生物

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

10楼: Originally posted by 夜舞龙 at 2011-12-01 21:09:16
楼上的都正解，高保真酶扩增是没有A的，不能T-A克隆。建议换平末端载体，可以直接克隆，比加A效果要好。比如用iInvitrogen平末端载体，或者国产的全式金平末端载体，我都用过，还是不错的。

做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上2分钟导入感受态DH5a摇床培养1小时后，在含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单菌落，挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时，用菌液PCR检测（所用引物于前面pcr的引物相同，反映条件也相同，只是94度预变性时间改为10分钟）。但是检测结果没有目的条带，只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您，这是什么原因？