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zhaolijunzly

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[求助] TA克隆不长菌

我的TA克隆不长菌，阳性对照很好，说明感受态没有问题，氨苄的板子是刚配的，连接比例1：9左右，哪出问题了呢？望同仁们指教一二，不胜感激！

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1楼 2011-11-21 08:08:27

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j2

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2011-11-21 11:07:31

加入感受态的质粒量在5ul内？
目的基因扩增是用高保真酶的话加A了？
目的基因和质粒是否保持良好？

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修炼ｉｎｇ，当虫仙……

2楼2011-11-21 10:17:22

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gjs713

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【答案】应助回帖

转化效率低；
连接有问题。

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勤奋、执着、专注，则无坚不破。

3楼2011-11-21 10:23:50

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wenqian0216

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★ ★ ★ ★ ★
zhaolijunzly: 金币+5, ★有帮助 2012-05-26 10:40:28

应该是连接有问题，延长连接时间。
或是回收电泳时有核酸酶末端TA被水解了，建议回收电泳前处理电泳槽

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4楼2012-05-19 09:50:31

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zhaolijunzly

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怎么发放金币

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5楼2012-06-05 13:07:44

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zhaolijunzly: 金币+5 2012-06-10 13:27:47

链接比例1:9不是很好吧，如果胶回收亮度还可以建议直接1：1就很好连了，目的片段浓度太高会影响连接质量的

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活出生而为龙的狷狂

6楼2012-06-07 18:15:40

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Marado

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我目前也遇到了这个问题，
加A后PCR产物：2ul
pMD 19：0.5ul
Buffer（solution I）3.5ul
过夜连接：12-16h
之后用JM109感受态细胞进行转化
涂LE平板（1ml的100mg/ml 氨苄加入到1L的LB培养基）
昨天下午2点半涂完平板（100ul菌液）
37℃培养到晚上10点半，之后置于室温下（20℃）到今早，发现没长- -

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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?

7楼2012-06-11 11:05:11

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zhaolijunzly

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引用回帖:

7楼: Originally posted by Marado at 2012-06-11 11:05:11
我目前也遇到了这个问题，
加A后PCR产物：2ul
pMD 19：0.5ul
Buffer（solution I）3.5ul
过夜连接：12-16h
之后用JM109感受态细胞进行转化
涂LE平板（1ml的100mg/ml 氨苄加入到1L的LB培养基）
昨天下午2点半 ...

你的PCR产物得胶回收后定量，才能连接。现在我的做出来了

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8楼2012-06-11 16:04:58

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