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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆不长菌
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zhaolijunzly

金虫 (小有名气)

[求助] TA克隆不长菌

我的TA克隆不长菌，阳性对照很好，说明感受态没有问题，氨苄的板子是刚配的，连接比例1：9左右，哪出问题了呢？望同仁们指教一二，不胜感激！
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1楼 2011-11-21 08:08:27
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j2

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2011-11-21 11:07:31
加入感受态的质粒量在5ul内？
目的基因扩增是用高保真酶的话加A了？
目的基因和质粒是否保持良好？
赞一下(2人) 回复此楼
修炼ｉｎｇ，当虫仙……
2楼2011-11-21 10:17:22
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

转化效率低；
连接有问题。
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
3楼2011-11-21 10:23:50
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wenqian0216

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zhaolijunzly: 金币+5, ★有帮助 2012-05-26 10:40:28
应该是连接有问题，延长连接时间。
或是回收电泳时有核酸酶末端TA被水解了，建议回收电泳前处理电泳槽
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4楼2012-05-19 09:50:31
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zhaolijunzly

金虫 (小有名气)
怎么发放金币
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5楼2012-06-05 13:07:44
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水月寺学徒

金虫 (小有名气)

江湖浪子，行游诗人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zhaolijunzly: 金币+5 2012-06-10 13:27:47
链接比例1:9不是很好吧，如果胶回收亮度还可以建议直接1：1就很好连了，目的片段浓度太高会影响连接质量的
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活出生而为龙的狷狂
6楼2012-06-07 18:15:40
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
我目前也遇到了这个问题，
加A后PCR产物：2ul
pMD 19：0.5ul
Buffer（solution I）3.5ul
过夜连接：12-16h
之后用JM109感受态细胞进行转化
涂LE平板（1ml的100mg/ml 氨苄加入到1L的LB培养基）
昨天下午2点半涂完平板（100ul菌液）
37℃培养到晚上10点半，之后置于室温下（20℃）到今早，发现没长- -
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
7楼2012-06-11 11:05:11
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zhaolijunzly

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Marado at 2012-06-11 11:05:11
我目前也遇到了这个问题，
加A后PCR产物：2ul
pMD 19：0.5ul
Buffer（solution I）3.5ul
过夜连接：12-16h
之后用JM109感受态细胞进行转化
涂LE平板（1ml的100mg/ml 氨苄加入到1L的LB培养基）
昨天下午2点半 ...

你的PCR产物得胶回收后定量，才能连接。现在我的做出来了
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8楼2012-06-11 16:04:58
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晓木蟲

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhaolijunzly at 2012-06-11 16:04:58
你的PCR产物得胶回收后定量，才能连接。现在我的做出来了...

PCR回收产物怎么定量？

发自小木虫Android客户端
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9楼2016-05-15 08:12:29
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bright8

铁杆木虫 (著名写手)
连接出了问题。

发自小木虫Android客户端
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10楼2016-05-15 10:42:14
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