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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 含信号肽的序列能否在原核表达系统PET-32a中表达
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龙开聪

金虫 (小有名气)

贵是一种态度

[求助] 含信号肽的序列能否在原核表达系统PET-32a中表达

我的目的基因序列含有一段信号肽以及终止子，我设计引物的时候全部加上去的，准备用于原核表达，后来听说含信号肽在原核系统中不能表达，不敢确认，特来求助各位高人、前辈，我用于表达的基因加不加信号肽和终止子，以及它们的作用分别是什么啊？是不是加了终止子就不利于我蛋白的纯化啊？望高人解惑！！谢谢，谢谢
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挺住
1楼 2011-11-17 09:37:50
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iamboy

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

龙开聪(金币+3): 谢谢好心人，那终止子呢？ 2011-11-17 14:36:47
引用回帖:
1楼: Originally posted by 龙开聪 at 2011-11-17 09:37:50:
我的目的基因序列含有一段信号肽以及终止子，我设计引物的时候全部加上去的，准备用于原核表达，后来听说含信号肽在原核系统中不能表达，不敢确认，特来求助各位高人、前辈，我用于表达的基因加不加信号肽和终止子 ...

信号肽是一段疏水性很强的氨基酸，一般用大肠杆菌表达含有信号肽的蛋白都是困难的，建议你重新pcr 构建，去掉信号肽，即使你也能表达出来，90%是包涵体。
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2楼2011-11-17 13:32:34
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xinyaolu

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
龙开聪(金币+2): 谢谢好心人，只剩两个金币了，全部给您了，我会尝试去掉信号肽和有信号肽的表达的，谢谢 2011-11-17 22:12:33
silicare(金币+5, BioEPI+1): 有价值 2011-11-18 10:54:55
楼上对信号肽的描述，略有异议，信号肽中存在一段疏水性较强的区域，但并不表示带信号肽就不适合在原核系统中表达，信号肽的存在可能会将蛋白定位于细胞质之外，这样蛋白有活性的概率就会更高。虽然信号肽本身的密码子及二级结构可能会影响外源蛋白的表达，但楼上似乎将包涵体产生的概率估高了。包涵体的产生和很多因素有关：基因来源，宿主等等。。。。        楼主可以先尝试带天然信号肽表达，也可以去掉天然信号肽后在pelB信号肽引导下表达。终止子是的终止转录的，不用加上，很多载体上带有终止子。要想方便纯化可以带标签，载体上的或者自己合成在引物上，这方面的手段可以自己选择。
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3楼2011-11-17 18:57:01
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啊Q精神

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3): 谢谢参与 2011-11-18 10:55:47
大肠杆菌分泌的蛋白极少，几乎没有，加入信号肽，能不能识别，能不能切割是个问题。大肠杆菌绝大多数都是胞内表达的。终止子的问题，楼上正解。
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4楼2011-11-17 19:52:54
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xinyaolu

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3): 鼓励交流 2011-11-18 10:56:09
大肠系统分泌外源蛋白缺失存在缺陷，但楼上以“几乎没有”来形容未免有点过头。楼主蛋白本身作为一种分泌型蛋白，完全可以尝试做分泌表达，在C端加标签进行纯化也是非常成熟的工作。野生信号肽无法引导分泌，可以尝试pelB，OmpA,DsbA 信号肽。蛋白的分泌本身就是一个非常巨大的研究课题，不做分泌尝试，就直接胞内表达，蛋白成包涵体的概率更高。用上清液做纯化总比提胞内省事。当然，做分泌也是考验人品，费劲的事情，如果只是为了纯化得到性质，做胞内也未尝不可。
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5楼2011-11-17 21:08:52
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exon2002

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
silicare(金币+3): 不错的主意！换真核宿主就更好了 2011-11-18 10:57:04
用昆虫载体及酵母载体表达成功地得到胞外标签蛋白。
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6楼2011-11-18 07:42:39
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yanshandai

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 龙开聪 at 2011-11-17 09:37:50:
我的目的基因序列含有一段信号肽以及终止子，我设计引物的时候全部加上去的，准备用于原核表达，后来听说含信号肽在原核系统中不能表达，不敢确认，特来求助各位高人、前辈，我用于表达的基因加不加信号肽和终止子 ...

原核细胞应该可以表达真核细胞带有信号肽的蛋白， 只不过真核的信号肽不起作用了。
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7楼2011-11-18 13:18:05
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小舟

木虫 (小有名气)
学习了
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不求最好，但求无过！
8楼2013-01-05 14:31:12
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