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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr过程中遇到的诡异现象，求高手解释一下
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兰色忧郁

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr过程中遇到的诡异现象，求高手解释一下

请教高手，小女子扩增诺卡氏菌属的目的基因，该株基因大小为10.9兆，扩增过程中出现了一直诡异现象，就是我设计的下游引物总是能同时作为另一个基因片段的正向引物和反向引物（ps，我设计的引物21bp可以匹配我的基因，14个可以完全匹配该基因），在基因组中扩增得到该基因，而且不管怎么提高退火温度（68度）都是该片段不是目的基因。这到底该怎么解释呢？我现在还有什么办法得到我的目的基因？关键是扩增我的两个目的基因都是这种情况。

谁能解释小女子不胜感激。
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1楼 2011-10-28 19:16:00
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

把引物弄长点试试？！
21可能有点短，特异性不好？
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2楼2011-10-29 08:51:56
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兰色忧郁

新虫 (初入文坛)
引物长度是27bp，能和目的基因匹配的是21个，问题是我设计的上游引物没用到啊，pcr过程中只用到了下游引物啊，这到底是怎么回事？
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3楼2011-10-29 13:02:32
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zhfge

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 同意!巢式可以验证! 2011-10-31 12:35:32
我觉得你可以考虑一下使用巢氏PCR哦，
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4楼2011-10-29 16:12:31
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小白虾

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以使用巢式PCR或者锅饼PCR试一下
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飞的更高
5楼2011-10-30 09:46:51
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

基因组太大，引物的特异性不强吧
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6楼2011-10-30 10:31:06
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junxiao0320

金虫 (小有名气)

学生

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助回帖! 2011-10-31 12:36:05
那你要检查一下（用BLAST），看他附近哪有匹配的地方。再从新设计一下引物，不怕长，可以通过胶回收你的目的片段，
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寻找方向，前进
7楼2011-10-31 10:22:13
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niushuaiji

金虫 (正式写手)

不放弃的小鸟

【答案】应助回帖

可以对扩增出的片段测序，和你的目的序列比对，分析原因！我看肯定是引物设计的问题，除了巢式PCR，还尝试可以设计颈环引物
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Tobeornottobe,that'saproblem
8楼2011-10-31 13:16:45
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兰色忧郁

新虫 (初入文坛)
我测序了，是基因组中另一段基因，最后13个碱基完全匹配，而且上下游是反相互补序列，也就是说这段基因的上游引物和下游引物是同一个。但是就算引物特异性不强，照理说也应该有我的目的片段啊，现在没有啊。
f:CCATATGCCGCCGATCCACGCCTTCGT  Tm 78.1  GC:63% 长度：23/27bp
r:CAAGCTTCAGACCGCCGGTGCTCGCCCgtcgattc Tm 80.1  GC:67.9%  长度：21/27bp
这是我的引物
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9楼2011-11-03 09:15:42
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