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belinda227木虫 (小有名气)
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[求助]
再次求助毕赤酵母无法分泌表达
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belinda227 wrote: 我的蛋白是个同源四聚体，每个亚基的分子量为57KD，是胞内酶，AT含量很高，达到60%。选取亚基的片段与pPICZαA构建了重组表达载体，电转化SMD-1168宿主菌。前期经过抗生素梯度抗性筛选，并经PCR验证正确。根据操作手册，用甲醇诱导其表达，在上清液中一直无法测到酶活。请各位毕赤酵母表达高手指点迷津，谢谢了！ 如上所述，是我前期在论坛上求助了帖子。该蛋白基因克隆自一种酵母，在大肠杆菌中实现了活力胞内表达，证实其为同源四聚体。经氨基酸序列分析发现N-端27个氨基酸可能是个线粒体前导肽（引导蛋白进入线粒体后会被切除）。是否有可能是该预测的前导肽的存在影响了在毕赤酵母SMD-1168中的分泌表达？或者还是有其他原因（如基因中存在信号肽切割位点，或者多亚基如何聚合等等）？现在正犹豫是否需要切除该前导肽序列，重新做一遍。但由于时间紧迫，故想先和大家探讨该种原因的可能性。非常感谢！ |
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