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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 急救啊！各位大虾，PCR扩基因有杂带(有图)！
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addictedfish

铁虫 (初入文坛)

[求助] 急救啊！各位大虾，PCR扩基因有杂带(有图)！

大家好！我是实验菜鸟，从油菜基因组直接P基因。都快一个月了，天天作重复工作，该考虑都考虑了，但是就是扩不出来东西。。现就把PCR体系和反应程序列出来。请各位大虾们多多指教啊 ？
        体系：10 x buffer            2.5ul，
             dNTP (2.5mM each)  3ul,  
                       25mM Mg+             2ul ,
                       上下引物各       1ul,
                      基因组DNA               3ul,
                   2.5U/ul Taq酶        0.4ul
                 加水至25ul

反应程序： 94    3min
                   94   30s
                   52   1mim
                   72    2min  共 32个循环。
           72     3min
              这是我做的最好的一次，我要上面的带，但是下面的非特异性带更亮啊？大家帮我看看。

图
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1楼 2011-10-24 11:09:50
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mascotte

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3, BioEPI+1): 可以考虑 2011-10-24 12:12:07
addictedfish(金币+6): 谢谢您的回帖，是要做转基因的。连克隆载体的。 2011-10-24 15:52:36
addictedfish(金币+4): 2011-11-29 10:07:10
引物设计的有问题吧，把引物在ncbi上blast一下，看看有没有其他的基因能被扩增出来。一些基因有结构相似的假基因（pseudogene），一些基因家族有保守型的结构域，如果你的引物设计在这些位置就没啥特异性了。如果PCR的目的是扩增要构建质粒的基因，可以把位置符合条件的条带切下来再PCR；如果是为了做半定量PCR就重新设计引物吧。
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2楼2011-10-24 11:18:53
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章信来

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
adslye(金币+5): 鼓励交流！实用主义，顶！ 2011-10-26 13:11:46
应该是引物设计的问题，如果有目的片段出来，最简便的方法就是把目的片段切下来，胶回收，克隆到T载体上，直接向下做，不必纠缠最佳扩增条件的问题。
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3楼2011-10-25 07:26:06
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惠子

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流~ 2011-10-26 13:12:00
dNTP浓度和DNA浓度可能过高
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不要等待机会，而要创造机会！
4楼2011-10-25 12:32:23
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xubo7

木虫之王 (文坛精英)

小木虫
3楼，我倾向
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人的品德很重要！！！不能失去德行！！！
5楼2011-10-26 08:34:21
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yituyitu

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流~~ 2011-10-26 13:12:10
引物不好，重新设计
或者把你认为正确的目标带切下来测序验证，然后再根据他设计引物
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6楼2011-10-26 10:58:21
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xiaoche

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可能是引物不是很特异，加上退火温度也不是很高，所以就容易产生许多杂带，不过如果有你的目的条带，杂带是可以忽略滴，呵呵
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7楼2011-10-26 21:55:28
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陈青chenqing

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流·祝顺利！ 2011-10-27 09:36:13
如果是试剂盒提的DNA那3ul也太多了，但是主要原因应该是退火温度和引物的问题吧  要看你的目的了，如果仅仅是为了获的目的基因，而你又知道哪个是目的基因，哪管他纯不纯呢   而且你那最底下的带肯定是引物二聚体
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自己的未来自己创造！
8楼2011-10-26 22:16:56
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liudh99

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
9楼2011-11-13 20:12:25
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cyz20050505

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2): 谢谢参与 2011-11-17 12:19:45
退火温度梯度摸索一下，不行的话，就按照你这个条件扩增，然后把你的目的大小的带割胶纯化，克隆测序看看，是不是你要的序列。如果是的话，那些非特异扩增就可以不用管，如果不是，就重新设计引物吧。一个PCR做一个月，你太有时间了，我只能说
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10楼2011-11-17 10:36:00
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