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addictedfish铁虫 (初入文坛)
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[求助]
急救啊！各位大虾，PCR扩基因有杂带(有图)！
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大家好！我是实验菜鸟，从油菜基因组直接P基因。都快一个月了，天天作重复工作，该考虑都考虑了，但是就是扩不出来东西。。现就把PCR体系和反应程序列出来。请各位大虾们多多指教啊 ？ 体系：10 x buffer 2.5ul， dNTP (2.5mM each) 3ul, 25mM Mg+ 2ul , 上下引物各 1ul, 基因组DNA 3ul, 2.5U/ul Taq酶 0.4ul 加水至25ul 反应程序： 94 3min 94 30s 52 1mim 72 2min 共 32个循环。 72 3min 这是我做的最好的一次，我要上面的带，但是下面的非特异性带更亮啊？大家帮我看看。  图   |
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9楼2011-11-13 20:12:25
mascotte
金虫 (正式写手)
- BioEPI: 2
- 应助: 10 (幼儿园)
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- 注册: 2008-01-07
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
silicare(金币+3, BioEPI+1): 可以考虑 2011-10-24 12:12:07
addictedfish(金币+6): 谢谢您的回帖，是要做转基因的。连克隆载体的。 2011-10-24 15:52:36
addictedfish(金币+4): 2011-11-29 10:07:10
silicare(金币+3, BioEPI+1): 可以考虑 2011-10-24 12:12:07
addictedfish(金币+6): 谢谢您的回帖，是要做转基因的。连克隆载体的。 2011-10-24 15:52:36
addictedfish(金币+4): 2011-11-29 10:07:10
| 引物设计的有问题吧，把引物在ncbi上blast一下，看看有没有其他的基因能被扩增出来。一些基因有结构相似的假基因（pseudogene），一些基因家族有保守型的结构域，如果你的引物设计在这些位置就没啥特异性了。如果PCR的目的是扩增要构建质粒的基因，可以把位置符合条件的条带切下来再PCR；如果是为了做半定量PCR就重新设计引物吧。 |
2楼2011-10-24 11:18:53
3楼2011-10-25 07:26:06
4楼2011-10-25 12:32:23
