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addictedfish

铁虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 28.5
散金: 10
帖子: 23
在线: 50.9小时
虫号: 1379236
注册: 2011-08-25
专业: 作物分子育种

[求助] 急救啊！各位大虾，PCR扩基因有杂带(有图)！

大家好！我是实验菜鸟，从油菜基因组直接P基因。都快一个月了，天天作重复工作，该考虑都考虑了，但是就是扩不出来东西。。现就把PCR体系和反应程序列出来。请各位大虾们多多指教啊？
      体系：10 x buffer          2.5ul，
         dNTP (2.5mM each)  3ul,
                     25mM Mg+          2ul ,
                     上下引物各    1ul,
                  基因组DNA             3ul,
               2.5U/ul Taq酶       0.4ul
               加水至25ul

反应程序： 94 3min
               94 30s
               52 1mim
               72 2min  共 32个循环。
         72    3min
            这是我做的最好的一次，我要上面的带，但是下面的非特异性带更亮啊？大家帮我看看。

图

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1楼 2011-10-24 11:09:50

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liudh99

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

9楼2011-11-13 20:12:25

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查看全部 12 个回答

mascotte

金虫 (正式写手)

BioEPI: 2
应助: 10 (幼儿园)
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帖子: 328
在线: 193.4小时
虫号: 492008
注册: 2008-01-07
专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3, BioEPI+1): 可以考虑 2011-10-24 12:12:07
addictedfish(金币+6): 谢谢您的回帖，是要做转基因的。连克隆载体的。 2011-10-24 15:52:36
addictedfish(金币+4): 2011-11-29 10:07:10

引物设计的有问题吧，把引物在ncbi上blast一下，看看有没有其他的基因能被扩增出来。一些基因有结构相似的假基因（pseudogene），一些基因家族有保守型的结构域，如果你的引物设计在这些位置就没啥特异性了。如果PCR的目的是扩增要构建质粒的基因，可以把位置符合条件的条带切下来再PCR；如果是为了做半定量PCR就重新设计引物吧。