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[求助]
相对定量荧光PCR求助
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本人刚接触分子，想请教各位牛人有关实时定量荧光PCR的一些问题。我要做不同土壤位点某类微生物的相对量的多少，所以想做相对定量PCR，初步的实验思路如下： 1提取各位点土壤中的DNA。 2实时荧光PCR。将某位点的DNA连续稀释7个10倍梯度，设定DNA的终拷贝数分别为100-10-7n/ul，用来做相对定量的标曲 3.已知这类微生物的特征基因A,用A基因扩增引物扩增上步中不同稀释倍数DNA中的A基因及其他位点样品的A基因。设定阈值，通过Ct值计算出各位点中A基因模板的相对拷贝数，从而得出各位点某类微生物的相对多少 不知道我的想法是不是对的？请各位指教，我会虚心接受大家的意见。另外我看好多有要管家基因，我这里需要管家基因嘛？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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西瓜
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【答案】应助回帖
物质鉴定(金币+10): 谢谢，你的建议对我很重要 2011-10-04 13:03:18
1949stone(MolEPI+1): 鼓励 2011-10-04 14:13:46
1949stone(MolEPI+1): 鼓励 2011-10-04 14:13:46
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就是这样了。内参基因是需要的，用于校正样品量的差异。 附件是个人认为比较好的一个荧光定量PCR的PPT，本版里有一个关于荧光定量PCR的热门资源，感兴趣也可以看看：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3234286&fpage=1 祝假期愉快，一切顺利！  |
2楼2011-10-03 17:38:00
红多多
木虫 (正式写手)
版筑饭牛的日子
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【答案】应助回帖
物质鉴定(金币+10): 谢谢，你的建议对我很重要 2011-10-04 12:59:45
1949stone(MolEPI+1): 鼓励 2011-10-04 14:13:56
1949stone(MolEPI+1): 鼓励 2011-10-04 14:13:56
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呵呵 你那个方法不需要用到内参的 因为你用的是拿一个位置的菌量作为参照，我建议你不要使用相对定量的方法，因为国际上这样做是很少的，如果你想发好一点的文章建议你做成绝对定量 方法是将你需要的基因克隆到T载体里面，摇细菌提质粒DNA，然后通过分光光度计计算出质粒DNA的质量，由于你使用T载体的分子量和你克隆的片段分子量是知道的，所以你能求出某浓度溶液中目的基因的拷贝数。通过稀释加上qPCR能得到一个ct值的标准曲线。利用这个标准曲线去计算你各个位置DNA浓度，这样貌似比较科学。 |
3楼2011-10-04 12:39:57
100