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小屁乖乖

铁虫 (初入文坛)

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专业: 果树学

[求助] SRAP分子标记跑不出好的条带

现在在做SRAP，为什么电泳出的条带那么少而且有几对引物之前还可以勉强扩增出条带在做就死活扩不出了，怀疑是引物的问题但引物也换过了，我用的PCR体系（共10μL体系）：10Xbuffer(含镁离子）2.0μL、dntp(10mM)0.5μL、引物（10μM/L)0.5μL、酶（5U/μL)0.2μL。8%聚丙烯酰胺凝胶电泳……

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1楼 2011-09-30 17:31:01

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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

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【答案】应助回帖

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西瓜(金币+5, MolEPI+1): 很在理啊！ 2011-09-30 23:43:06
小屁乖乖(金币+2): 2011-10-12 16:29:13

1、10ul 的体系用10Xbuffer(含镁离子）2.0μL，什么意思？为什么用2ul而不用1ul。没有Buffer和镁离子分开的试剂？
2、10ul体系，体系小，不稳定，建议20ul体系！
3、泳道上面全是黑的，模板有降解！
4、SRAP是RAPD的变种，稳定性稍微强于RAPD，但也没有强到那里去，一定程度的不稳定仍然存在。
5、开始扩增时遇到有差异的条带，可以挖出来稀释再P一次，连到载体上两端测序，后根据测序结果多加几个核苷酸设计引物，将其转化为稳定的标记。