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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何加polyA尾巴。
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380218013

金虫 (小有名气)

[求助] 如何加polyA尾巴。

小弟用高保真酶PCR，胶回收之后想与T载体相连，需要在产物后加polyA的尾巴。在网上看到说纯化后加Taq酶72度10min 。但是是否还要加buffe等其他的试剂？如果加，加的体系是多少？反应条件是什么？小弟想知道具体的步骤。


请有过实战经验的大虾们帮忙！谢谢！
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好好生活，努力赚钱
1楼 2011-09-13 21:37:24
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-09-14 07:32:29
380218013(金币+1): 好像只要72度 30min 吧 要加buffer 什么的 2011-09-14 16:44:06
跟你平时做PCR的体系一样，只不过将dNTP换成dATP ！
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真相是最大的奢侈品
2楼2011-09-13 22:00:19
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-09-14 18:14:20
引用回帖:
2楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-13 22:00:19:
跟你平时做PCR的体系一样，只不过将dNTP换成dATP ！

跟你平时做PCR的体系一样，只不过将dNTP换成dATP ！
扩增程序就按你说的就可以了！
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真相是最大的奢侈品
3楼2011-09-14 17:50:26
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quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 是这样的 2011-09-14 22:14:22
不用了，就在pfu程序完了后，加点儿taq酶就可以了，不需要再加什么dATP的！
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致良知
4楼2011-09-14 21:44:43
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alice

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by quiller2000 at 2011-09-14 21:44:43:
不用了，就在pfu程序完了后，加点儿taq酶就可以了，不需要再加什么dATP的！

可以吗？我之前按胶回收后加dATP，72度加A好像不行呢...
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To be strong enough
5楼2011-09-16 10:43:11
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xiaoche

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-09-17 10:49:32
就后期加点你普通的PCR反应mix, 你用的酶不产生A粘端，随便加点普通的taq酶，然后加点buffer,dNTP,在72度反应十分钟就可以了。
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6楼2011-09-16 15:44:20
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-09-17 10:49:41
我是回收后，加buffer，加dATP，加一般的酶，然后72度半小时，连上去了。
方法较复杂，可参考上面的简单方法！
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真相是最大的奢侈品
7楼2011-09-16 16:17:47
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临风7071

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-09-18 08:12:34
380218013(金币+4): 谢谢啊 ！ 看到 2011-09-19 11:16:30
建议楼主去看看promega的T载体说明书，上面有很好的解释。而且向楼上极为所说的，用高保真酶PCR完，不回收，直接加A，这样可能加不上，因为高保真酶具有3‘-5’外切酶的活性，你刚加上就被切掉了。。。。这些在promega的T载体都有说明的。
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8楼2011-09-17 22:48:52
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madengyu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
9楼2011-09-18 16:54:44
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380218013

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 临风7071 at 2011-09-17 22:48:52:
建议楼主去看看promega的T载体说明书，上面有很好的解释。而且向楼上极为所说的，用高保真酶PCR完，不回收，直接加A，这样可能加不上，因为高保真酶具有3‘-5’外切酶的活性，你刚加上就被切掉了。。。。这些在pr ...

说明书上没有啊 大哥。。你把你的说明书发给我？？chengchunming2006@yahoo.com.cn 谢谢
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好好生活，努力赚钱
10楼2011-09-18 20:02:06
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