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1楼 2011-09-05 21:45:00

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wanhscn

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dhd997(金币+2): 鼓励热心版版 2011-09-06 07:38:23
shuihaizi(金币+2): 2011-09-06 08:59:19

载体或者目的片段去磷酸化，否则载体自连的较多，不易挑到！

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2楼2011-09-05 22:09:31

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瓶儿花

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wanhscn(金币+2): 比较准确！ 2011-09-06 09:58:28
shuihaizi(金币+2): 2011-09-06 11:52:14

载体去磷酸化，不然会自连，目的片段可以不用去磷酸化的。做的时候加对照，以不加目的片段，只加酶切并去磷酸化的载体的连接液为对照，就能知道你载体去磷酸化的效果了。

3楼2011-09-06 09:53:27

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wanhscn

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引用回帖:

2楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-05 22:09:31:
载体或者目的片段去磷酸化，否则载体自连的较多，不易挑到！

表述有误，载体必须去磷酸化！

真相是最大的奢侈品

4楼2011-09-06 10:00:01

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shuihaizi

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你们的意思是没有去磷酸化，连上的可能性很小是吗?
另外，是不是因为我的目的片段太大啊？快和载体一样大了，不知道怎么样的连接比例较好？

5楼2011-09-06 11:51:57

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wanhscn(金币+2): good 2011-09-06 14:13:54
shuihaizi(金币+2): 2011-09-06 16:25:18

目的片段比较大没有关系的，载体必须要去磷酸化的，因为你做的是单酶切。没有去磷酸化很容易自连。连接的反应体系不应过大。体系过大，浓度越低，分子碰撞的概率越低，这样连接的概率也就越低了。一般连接的反应体系为10μL.
载体 1μL
目的片段 7μL
10×T4 DNA ligase 1μL
T4 DNA ligase 1μL
16℃连接过夜。
注意要加好对照，这样便于你分析结果。
祝你好运！

6楼2011-09-06 12:33:28

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shuihaizi(金币+2): 2011-09-06 16:25:35

应该好连的你连过夜后你可以转化前跑一个核酸电泳对照一下与你连接的东西之后再用 xl10-gold菌转化指定能连上的

7楼2011-09-06 13:30:17

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shuihaizi(金币+3): 2011-09-06 16:26:05
西瓜(金币+5): Good 2011-09-06 17:25:33

1.如果是用T4连接酶，按20ul体系：
载体 100ng
目的片段 500-1000ng
10×T4 DNA ligase 2μL
T4 DNA ligase 1μL
25℃连接30min。
片段不需去磷
2.如果用快速克隆酶（该方法阳性率很高）
载体 100ng
目的片段 100-300ng
10×快速克隆酶buffer 2μL
快速克隆酶 2μL
25℃连接30min。
片段不需去磷

本人构建过二十多个克隆，90%一次性成功

8楼2011-09-06 14:15:23

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7楼: Originally posted by 36894256 at 2011-09-06 13:30:17:
应该好连的你连过夜后你可以转化前跑一个核酸电泳对照一下与你连接的东西之后再用 xl10-gold菌转化指定能连上的

我用的事Takara的T4连接酶，25度30分钟行吗？谢谢

9楼2011-09-06 16:27:38

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5楼: Originally posted by shuihaizi at 2011-09-06 11:51:57:
你们的意思是没有去磷酸化，连上的可能性很小是吗?
另外，是不是因为我的目的片段太大啊？快和载体一样大了，不知道怎么样的连接比例较好？

能推荐个去磷酸化的体系及用到的试剂吗（哪个公司的什么酶，什么体系？）我之前做克隆一直没有去磷酸化。谢谢