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pUC19-SalI单酶切，连个2500片段，连不上？
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最近在做单酶切连接，怎么也连不上，请大家帮忙！ pUC19和2500bp的目的片段通过SalI单酶切，进行连接，不知道什么原因总是连不上？  本不应该难连啊？ |
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
shuihaizi(金币+3): 2011-09-06 16:26:05
西瓜(金币+5): Good 2011-09-06 17:25:33
shuihaizi(金币+3): 2011-09-06 16:26:05
西瓜(金币+5): Good 2011-09-06 17:25:33
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1.如果是用T4连接酶，按20ul体系： 载体 100ng 目的片段 500-1000ng 10×T4 DNA ligase 2μL T4 DNA ligase 1μL 25℃连接30min。 片段不需去磷 2.如果用快速克隆酶（该方法阳性率很高） 载体 100ng 目的片段 100-300ng 10×快速克隆酶buffer 2μL 快速克隆酶 2μL 25℃连接30min。 片段不需去磷 本人构建过二十多个克隆，90%一次性成功 |
8楼2011-09-06 14:15:23
wanhscn
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2楼2011-09-05 22:09:31
3楼2011-09-06 09:53:27
wanhscn
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4楼2011-09-06 10:00:01
