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shuihaizi

金虫 (小有名气)

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[求助] pUC19-SalI单酶切，连个2500片段，连不上？

最近在做单酶切连接，怎么也连不上，请大家帮忙！
pUC19和2500bp的目的片段通过SalI单酶切，进行连接，不知道什么原因总是连不上？

本不应该难连啊？

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1楼2011-09-05 21:45:00

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hjpcy

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
shuihaizi(金币+3): 2011-09-06 16:26:05
西瓜(金币+5): Good 2011-09-06 17:25:33

1.如果是用T4连接酶，按20ul体系：
载体 100ng
目的片段 500-1000ng
10×T4 DNA ligase 2μL
T4 DNA ligase 1μL
25℃连接30min。
片段不需去磷
2.如果用快速克隆酶（该方法阳性率很高）
载体 100ng
目的片段 100-300ng
10×快速克隆酶buffer 2μL
快速克隆酶 2μL
25℃连接30min。
片段不需去磷

本人构建过二十多个克隆，90%一次性成功