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shuihaizi

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[求助] pUC19-SalI单酶切，连个2500片段，连不上？

最近在做单酶切连接，怎么也连不上，请大家帮忙！
pUC19和2500bp的目的片段通过SalI单酶切，进行连接，不知道什么原因总是连不上？

本不应该难连啊？

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1楼2011-09-05 21:45:00

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金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): good 2011-09-06 14:13:54
shuihaizi(金币+2): 2011-09-06 16:25:18

目的片段比较大没有关系的，载体必须要去磷酸化的，因为你做的是单酶切。没有去磷酸化很容易自连。连接的反应体系不应过大。体系过大，浓度越低，分子碰撞的概率越低，这样连接的概率也就越低了。一般连接的反应体系为10μL.
载体 1μL
目的片段 7μL
10×T4 DNA ligase 1μL
T4 DNA ligase 1μL
16℃连接过夜。
注意要加好对照，这样便于你分析结果。
祝你好运！