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一曲清心

新虫 (初入文坛)

[求助] 小麦叶片RNA实时荧光Ct值过高

小虫最近想做小麦叶片RNA的表达分析,cDNA做了1、2、4、8、16、32、64、128倍的稀释梯度,用内参GAPDH跑,怎么Ct值都在32~34之间啊?居然浓度高的Ct值比浓度低的Ct值大!扩增效率没问题,有的浓度下重复不是很稳定,求高手帮忙解释。
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庄稼不收得年年种!
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hxsm

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

一曲清心(金币+10): 10 2011-08-27 22:33:05
amisking(APEPI+1): 鼓励应助 2011-08-27 23:34:38
看看,你的RNA纯度,还有反转录是不是标准的,之后就是CDNA稀释后要用手弹均匀,不可用力过度,一般很少出现荧光结果不稳定的,还有你的荧光定量过高,可能是你的基因表达浓度过低,基因表达丰度低。。。内参基因咋样?内参可以换个试试。。。
静水深流
3楼2011-08-27 19:47:48
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27927025

金虫 (正式写手)

我也不知道,也遇到相似问题
2楼2011-08-27 17:45:35
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一曲清心

新虫 (初入文坛)

★ ★
jhu132llh(金币+2): good 2011-08-28 08:39:48
引用回帖:
3楼: Originally posted by hxsm at 2011-08-27 19:47:48:
看看,你的RNA纯度,还有反转录是不是标准的,之后就是CDNA稀释后要用手弹均匀,不可用力过度,一般很少出现荧光结果不稳定的,还有你的荧光定量过高,可能是你的基因表达浓度过低,基因表达丰度低。。。内参基因 ...

A260/280在2.0~2.2,用的罗氏的反转试剂盒,稀释时是用枪头吸打的。晚上又做了一遍稀释2倍、8倍、32倍,Ct降小了,值都在26左右,还是分不开,仪器显示的扩增效率在90%~110%之间。重复之间误差较大....
庄稼不收得年年种!
4楼2011-08-27 22:38:35
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hxsm

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
jhu132llh(金币+3): good,引经据典,鼓励热心虫友积极应助 2011-08-29 16:52:35
具体的荧光定量还是比较复杂的,你可以试试做做NTC,就是没有做反转录的RNA为模板试试,看有没有基因组的污染,你做的溶解曲线咋样,扩增特异性,还有引物设计等等,有些荧光定量试剂盒是对于引物是有他自己的要求。。。荧光定量最重要的一个是模板一个是你的样品,还有就是你的试验设计。。。看你上面说的,你做这个试验时间长吗,你稀释的时候样品混匀有点问题,还有就是加样品的时候是不是标准,一般枪头上最后的一滴也是要加进去的。。。慢慢试试,,,
静水深流
5楼2011-08-29 11:07:05
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