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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » 小麦叶片RNA实时荧光Ct值过高
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一曲清心

新虫 (初入文坛)

[求助] 小麦叶片RNA实时荧光Ct值过高

小虫最近想做小麦叶片RNA的表达分析，cDNA做了1、2、4、8、16、32、64、128倍的稀释梯度，用内参GAPDH跑，怎么Ct值都在32~34之间啊？居然浓度高的Ct值比浓度低的Ct值大！扩增效率没问题，有的浓度下重复不是很稳定，求高手帮忙解释。
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庄稼不收得年年种！
1楼 2011-08-27 17:41:41
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27927025

金虫 (正式写手)
我也不知道，也遇到相似问题
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2楼2011-08-27 17:45:35
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hxsm

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

一曲清心(金币+10): 10 2011-08-27 22:33:05
amisking(APEPI+1): 鼓励应助 2011-08-27 23:34:38
看看，你的RNA纯度，还有反转录是不是标准的，之后就是CDNA稀释后要用手弹均匀，不可用力过度，一般很少出现荧光结果不稳定的，还有你的荧光定量过高，可能是你的基因表达浓度过低，基因表达丰度低。。。内参基因咋样？内参可以换个试试。。。
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静水深流
3楼2011-08-27 19:47:48
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一曲清心

新虫 (初入文坛)
★ ★
jhu132llh(金币+2): good 2011-08-28 08:39:48
引用回帖:
3楼: Originally posted by hxsm at 2011-08-27 19:47:48:
看看，你的RNA纯度，还有反转录是不是标准的，之后就是CDNA稀释后要用手弹均匀，不可用力过度，一般很少出现荧光结果不稳定的，还有你的荧光定量过高，可能是你的基因表达浓度过低，基因表达丰度低。。。内参基因 ...

A260/280在2.0~2.2，用的罗氏的反转试剂盒，稀释时是用枪头吸打的。晚上又做了一遍稀释2倍、8倍、32倍，Ct降小了，值都在26左右，还是分不开，仪器显示的扩增效率在90%~110%之间。重复之间误差较大....
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庄稼不收得年年种！
4楼2011-08-27 22:38:35
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hxsm

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
jhu132llh(金币+3): good,引经据典，鼓励热心虫友积极应助 2011-08-29 16:52:35
具体的荧光定量还是比较复杂的，你可以试试做做NTC，就是没有做反转录的RNA为模板试试，看有没有基因组的污染，你做的溶解曲线咋样，扩增特异性，还有引物设计等等，有些荧光定量试剂盒是对于引物是有他自己的要求。。。荧光定量最重要的一个是模板一个是你的样品，还有就是你的试验设计。。。看你上面说的，你做这个试验时间长吗，你稀释的时候样品混匀有点问题，还有就是加样品的时候是不是标准，一般枪头上最后的一滴也是要加进去的。。。慢慢试试，，，
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静水深流
5楼2011-08-29 11:07:05
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一曲清心

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hxsm at 2011-08-29 11:07:05:
具体的荧光定量还是比较复杂的，你可以试试做做NTC，就是没有做反转录的RNA为模板试试，看有没有基因组的污染，你做的溶解曲线咋样，扩增特异性，还有引物设计等等，有些荧光定量试剂盒是对于引物是有他自己的要求 ...

溶解曲线挺好的，引物应该没问题。RNA是经过DNA消化的，电泳显示没有基因组DNA。昨天另外做了一个，稀释了4倍、8倍和16倍，结果，4倍和8倍浓度的在前五个循环就有荧光了，16倍的Ct却又升到33左右了....
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庄稼不收得年年种！
6楼2011-08-30 08:22:20
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