24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 1685  |  回复: 5
本帖产生 1 个 APEPI ,点击这里进行查看

一曲清心

新虫 (初入文坛)

[求助] 小麦叶片RNA实时荧光Ct值过高

小虫最近想做小麦叶片RNA的表达分析,cDNA做了1、2、4、8、16、32、64、128倍的稀释梯度,用内参GAPDH跑,怎么Ct值都在32~34之间啊?居然浓度高的Ct值比浓度低的Ct值大!扩增效率没问题,有的浓度下重复不是很稳定,求高手帮忙解释。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

庄稼不收得年年种!
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

27927025

金虫 (正式写手)

我也不知道,也遇到相似问题
2楼2011-08-27 17:45:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hxsm

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

一曲清心(金币+10): 10 2011-08-27 22:33:05
amisking(APEPI+1): 鼓励应助 2011-08-27 23:34:38
看看,你的RNA纯度,还有反转录是不是标准的,之后就是CDNA稀释后要用手弹均匀,不可用力过度,一般很少出现荧光结果不稳定的,还有你的荧光定量过高,可能是你的基因表达浓度过低,基因表达丰度低。。。内参基因咋样?内参可以换个试试。。。
静水深流
3楼2011-08-27 19:47:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一曲清心

新虫 (初入文坛)

★ ★
jhu132llh(金币+2): good 2011-08-28 08:39:48
引用回帖:
3楼: Originally posted by hxsm at 2011-08-27 19:47:48:
看看,你的RNA纯度,还有反转录是不是标准的,之后就是CDNA稀释后要用手弹均匀,不可用力过度,一般很少出现荧光结果不稳定的,还有你的荧光定量过高,可能是你的基因表达浓度过低,基因表达丰度低。。。内参基因 ...

A260/280在2.0~2.2,用的罗氏的反转试剂盒,稀释时是用枪头吸打的。晚上又做了一遍稀释2倍、8倍、32倍,Ct降小了,值都在26左右,还是分不开,仪器显示的扩增效率在90%~110%之间。重复之间误差较大....
庄稼不收得年年种!
4楼2011-08-27 22:38:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hxsm

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
jhu132llh(金币+3): good,引经据典,鼓励热心虫友积极应助 2011-08-29 16:52:35
具体的荧光定量还是比较复杂的,你可以试试做做NTC,就是没有做反转录的RNA为模板试试,看有没有基因组的污染,你做的溶解曲线咋样,扩增特异性,还有引物设计等等,有些荧光定量试剂盒是对于引物是有他自己的要求。。。荧光定量最重要的一个是模板一个是你的样品,还有就是你的试验设计。。。看你上面说的,你做这个试验时间长吗,你稀释的时候样品混匀有点问题,还有就是加样品的时候是不是标准,一般枪头上最后的一滴也是要加进去的。。。慢慢试试,,,
静水深流
5楼2011-08-29 11:07:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一曲清心

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by hxsm at 2011-08-29 11:07:05:
具体的荧光定量还是比较复杂的,你可以试试做做NTC,就是没有做反转录的RNA为模板试试,看有没有基因组的污染,你做的溶解曲线咋样,扩增特异性,还有引物设计等等,有些荧光定量试剂盒是对于引物是有他自己的要求 ...

溶解曲线挺好的,引物应该没问题。RNA是经过DNA消化的,电泳显示没有基因组DNA。昨天另外做了一个,稀释了4倍、8倍和16倍,结果,4倍和8倍浓度的在前五个循环就有荧光了,16倍的Ct却又升到33左右了....
庄稼不收得年年种!
6楼2011-08-30 08:22:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 一曲清心 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 302分求调剂 +9 凡语祈愿 2026-04-08 10/500 2026-04-10 23:26 by 314126402
[考研] 本科南方医科大学 一志愿985 药学学硕284分 求调剂 +4 弱水听文 2026-04-09 4/200 2026-04-10 22:01 by doctff
[考研] 280求调剂 +12 李rien 2026-04-04 12/600 2026-04-10 21:19 by zhouxiaoyu
[考研] 303求调剂 +7 SereinQ 2026-04-10 8/400 2026-04-10 21:08 by gong120082
[考研] 071000生物学调剂求助 +17 zzzzwww 2026-04-09 20/1000 2026-04-10 15:55 by 求调剂zz
[考研] 一志愿西交机械专硕求调剂 +8 求上岸的小王 2026-04-10 8/400 2026-04-10 15:09 by hemengdong
[考研] 282,求调剂 +10 jggshjkkm 2026-04-09 12/600 2026-04-10 14:53 by 逆水乘风
[考研] 材料专硕(0856) 339分求调剂 +11 哈哈哈鹅哈哈哈 2026-04-04 11/550 2026-04-10 09:37 by 690616278
[考研] 一志愿双非085400电子信息344 求调剂,对材料和化学方向也感兴趣 +8 无情的小羊 2026-04-09 9/450 2026-04-10 09:30 by 松花缸1201
[考研] 材料299专硕求调剂 +10 +21 2026-04-09 10/500 2026-04-09 17:34 by 1753564080
[考研] 085801 总分275 本科新能源 求调剂 +8 bradoner 2026-04-08 9/450 2026-04-09 13:43 by only周
[考研] 328求调剂 +17 lftmya 2026-04-07 18/900 2026-04-09 08:05 by 5268321
[考研] 085404,334分,求调剂 +5 sunjie8888 2026-04-08 8/400 2026-04-09 07:26 by sunjie8888
[考研] 296求调剂 +3 汪!?! 2026-04-08 3/150 2026-04-08 22:00 by zhouyuwinner
[考研] 考研求调剂 +4 雯??? 2026-04-08 4/200 2026-04-08 21:44 by 土木硕士招生
[考研] 318求调剂 +13 ykyhsa 2026-04-05 15/750 2026-04-08 21:37 by wj165256
[考研] 材料考研求调剂总分280 +30 mkjlz1 2026-04-06 35/1750 2026-04-08 21:25 by cyh—315
[考研] 283分求调剂 +14 试试看呗 2026-04-04 14/700 2026-04-08 07:03 by lijunpoly
[考研] 304求调剂(085602,过四级,一志愿985) +25 化工人999 2026-04-04 26/1300 2026-04-07 22:06 by hemengdong
[考研] 085600调剂 +9 东照照照 2026-04-04 9/450 2026-04-05 13:44 by ujn_zhuj
信息提示
请填处理意见