24小时热门版块排行榜    

查看: 1650  |  回复: 5
本帖产生 1 个 APEPI ,点击这里进行查看

一曲清心

新虫 (初入文坛)

[求助] 小麦叶片RNA实时荧光Ct值过高

小虫最近想做小麦叶片RNA的表达分析,cDNA做了1、2、4、8、16、32、64、128倍的稀释梯度,用内参GAPDH跑,怎么Ct值都在32~34之间啊?居然浓度高的Ct值比浓度低的Ct值大!扩增效率没问题,有的浓度下重复不是很稳定,求高手帮忙解释。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

庄稼不收得年年种!
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

27927025

金虫 (正式写手)

我也不知道,也遇到相似问题
2楼2011-08-27 17:45:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hxsm

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

一曲清心(金币+10): 10 2011-08-27 22:33:05
amisking(APEPI+1): 鼓励应助 2011-08-27 23:34:38
看看,你的RNA纯度,还有反转录是不是标准的,之后就是CDNA稀释后要用手弹均匀,不可用力过度,一般很少出现荧光结果不稳定的,还有你的荧光定量过高,可能是你的基因表达浓度过低,基因表达丰度低。。。内参基因咋样?内参可以换个试试。。。
静水深流
3楼2011-08-27 19:47:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一曲清心

新虫 (初入文坛)

★ ★
jhu132llh(金币+2): good 2011-08-28 08:39:48
引用回帖:
3楼: Originally posted by hxsm at 2011-08-27 19:47:48:
看看,你的RNA纯度,还有反转录是不是标准的,之后就是CDNA稀释后要用手弹均匀,不可用力过度,一般很少出现荧光结果不稳定的,还有你的荧光定量过高,可能是你的基因表达浓度过低,基因表达丰度低。。。内参基因 ...

A260/280在2.0~2.2,用的罗氏的反转试剂盒,稀释时是用枪头吸打的。晚上又做了一遍稀释2倍、8倍、32倍,Ct降小了,值都在26左右,还是分不开,仪器显示的扩增效率在90%~110%之间。重复之间误差较大....
庄稼不收得年年种!
4楼2011-08-27 22:38:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hxsm

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
jhu132llh(金币+3): good,引经据典,鼓励热心虫友积极应助 2011-08-29 16:52:35
具体的荧光定量还是比较复杂的,你可以试试做做NTC,就是没有做反转录的RNA为模板试试,看有没有基因组的污染,你做的溶解曲线咋样,扩增特异性,还有引物设计等等,有些荧光定量试剂盒是对于引物是有他自己的要求。。。荧光定量最重要的一个是模板一个是你的样品,还有就是你的试验设计。。。看你上面说的,你做这个试验时间长吗,你稀释的时候样品混匀有点问题,还有就是加样品的时候是不是标准,一般枪头上最后的一滴也是要加进去的。。。慢慢试试,,,
静水深流
5楼2011-08-29 11:07:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一曲清心

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by hxsm at 2011-08-29 11:07:05:
具体的荧光定量还是比较复杂的,你可以试试做做NTC,就是没有做反转录的RNA为模板试试,看有没有基因组的污染,你做的溶解曲线咋样,扩增特异性,还有引物设计等等,有些荧光定量试剂盒是对于引物是有他自己的要求 ...

溶解曲线挺好的,引物应该没问题。RNA是经过DNA消化的,电泳显示没有基因组DNA。昨天另外做了一个,稀释了4倍、8倍和16倍,结果,4倍和8倍浓度的在前五个循环就有荧光了,16倍的Ct却又升到33左右了....
庄稼不收得年年种!
6楼2011-08-30 08:22:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 一曲清心 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 22 350 本科985求调剂,求老登收留 +3 李轶男003 2026-03-20 3/150 2026-03-21 13:28 by 搏击518
[考研] 330求调剂0854 +3 assdll 2026-03-21 3/150 2026-03-21 13:01 by 搏击518
[考研] 070300化学319求调剂 +7 锦鲤0909 2026-03-17 7/350 2026-03-21 03:46 by JourneyLucky
[考研] 一志愿武理材料305分求调剂 +6 想上岸的鲤鱼 2026-03-18 7/350 2026-03-21 01:03 by JourneyLucky
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-03-18 6/300 2026-03-21 00:32 by JourneyLucky
[考研] 274求调剂 +10 S.H1 2026-03-18 10/500 2026-03-20 23:51 by JourneyLucky
[考研] 295求调剂 +4 一志愿京区211 2026-03-18 6/300 2026-03-20 23:41 by JourneyLucky
[考研] 材料学硕297已过四六级求调剂推荐 +11 adaie 2026-03-19 11/550 2026-03-20 21:30 by laoshidan
[考研] 一志愿北京化工大学0703化学318分,有科研经历,求调剂 +4 一瓶苯甲酸 2026-03-14 4/200 2026-03-20 20:36 by fen_rao
[考研] 材料学求调剂 +4 Stella_Yao 2026-03-20 4/200 2026-03-20 20:28 by ms629
[考研] 一志愿 南京航空航天大学大学 ,080500材料科学与工程学硕 +5 @taotao 2026-03-20 5/250 2026-03-20 20:16 by JourneyLucky
[考研] 招收调剂硕士 +4 lidianxing 2026-03-19 12/600 2026-03-20 12:25 by lidianxing
[考研] 286求调剂 +6 lemonzzn 2026-03-16 10/500 2026-03-19 14:31 by lemonzzn
[考研] 277调剂 +5 自由煎饼果子 2026-03-16 6/300 2026-03-17 19:26 by 李leezz
[考研] 有没有道铁/土木的想调剂南林,给自己招师弟中~ +3 TqlXswl 2026-03-16 7/350 2026-03-17 15:23 by TqlXswl
[考研] 一志愿苏州大学材料工程(085601)专硕有科研经历三项国奖两个实用型专利一项省级立项 +6 大火山小火山 2026-03-16 8/400 2026-03-17 15:05 by 无懈可击111
[考研] 一志愿南京大学,080500材料科学与工程,调剂 +4 Jy? 2026-03-16 4/200 2026-03-17 11:02 by gaoqiong
[论文投稿] 有没有大佬发小论文能带我个二作 +3 增锐漏人 2026-03-17 4/200 2026-03-17 09:26 by xs74101122
[考研] 11408 一志愿西电,277分求调剂 +3 zhouzhen654 2026-03-16 3/150 2026-03-17 07:03 by laoshidan
[考研] 东南大学364求调剂 +5 JasonYuiui 2026-03-15 5/250 2026-03-16 21:28 by 木瓜膏
信息提示
请填处理意见