应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » 小麦叶片RNA实时荧光Ct值过高
61/1返回列表
查看: 1905  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 APEPI ，点击这里进行查看

一曲清心

新虫 (初入文坛)

[求助] 小麦叶片RNA实时荧光Ct值过高

小虫最近想做小麦叶片RNA的表达分析，cDNA做了1、2、4、8、16、32、64、128倍的稀释梯度，用内参GAPDH跑，怎么Ct值都在32~34之间啊？居然浓度高的Ct值比浓度低的Ct值大！扩增效率没问题，有的浓度下重复不是很稳定，求高手帮忙解释。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
庄稼不收得年年种！
1楼 2011-08-27 17:41:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

27927025

金虫 (正式写手)
我也不知道，也遇到相似问题
赞一下 回复此楼
2楼2011-08-27 17:45:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hxsm

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

一曲清心(金币+10): 10 2011-08-27 22:33:05
amisking(APEPI+1): 鼓励应助 2011-08-27 23:34:38
看看，你的RNA纯度，还有反转录是不是标准的，之后就是CDNA稀释后要用手弹均匀，不可用力过度，一般很少出现荧光结果不稳定的，还有你的荧光定量过高，可能是你的基因表达浓度过低，基因表达丰度低。。。内参基因咋样？内参可以换个试试。。。
赞一下(1人) 回复此楼
静水深流
3楼2011-08-27 19:47:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一曲清心

新虫 (初入文坛)
★ ★
jhu132llh(金币+2): good 2011-08-28 08:39:48
引用回帖:
3楼: Originally posted by hxsm at 2011-08-27 19:47:48:
看看，你的RNA纯度，还有反转录是不是标准的，之后就是CDNA稀释后要用手弹均匀，不可用力过度，一般很少出现荧光结果不稳定的，还有你的荧光定量过高，可能是你的基因表达浓度过低，基因表达丰度低。。。内参基因 ...

A260/280在2.0~2.2，用的罗氏的反转试剂盒，稀释时是用枪头吸打的。晚上又做了一遍稀释2倍、8倍、32倍，Ct降小了，值都在26左右，还是分不开，仪器显示的扩增效率在90%~110%之间。重复之间误差较大....
赞一下(1人) 回复此楼
庄稼不收得年年种！
4楼2011-08-27 22:38:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hxsm

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
jhu132llh(金币+3): good,引经据典，鼓励热心虫友积极应助 2011-08-29 16:52:35
具体的荧光定量还是比较复杂的，你可以试试做做NTC，就是没有做反转录的RNA为模板试试，看有没有基因组的污染，你做的溶解曲线咋样，扩增特异性，还有引物设计等等，有些荧光定量试剂盒是对于引物是有他自己的要求。。。荧光定量最重要的一个是模板一个是你的样品，还有就是你的试验设计。。。看你上面说的，你做这个试验时间长吗，你稀释的时候样品混匀有点问题，还有就是加样品的时候是不是标准，一般枪头上最后的一滴也是要加进去的。。。慢慢试试，，，
赞一下(1人) 回复此楼
静水深流
5楼2011-08-29 11:07:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一曲清心

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hxsm at 2011-08-29 11:07:05:
具体的荧光定量还是比较复杂的，你可以试试做做NTC，就是没有做反转录的RNA为模板试试，看有没有基因组的污染，你做的溶解曲线咋样，扩增特异性，还有引物设计等等，有些荧光定量试剂盒是对于引物是有他自己的要求 ...

溶解曲线挺好的，引物应该没问题。RNA是经过DNA消化的，电泳显示没有基因组DNA。昨天另外做了一个，稀释了4倍、8倍和16倍，结果，4倍和8倍浓度的在前五个循环就有荧光了，16倍的Ct却又升到33左右了....
赞一下 回复此楼
庄稼不收得年年种！
6楼2011-08-30 08:22:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 一曲清心 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 言之凿凿，8月21号(明天)放榜 +13 医学老男孩 2026-08-20 15/750 2026-08-20 15:19 by chengyan1220
[基金申请] 时间戳又变了 +3 wuchongjun 2026-08-20 4/200 2026-08-20 15:18 by felixwseu
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +17 基诺咪客 2026-08-17 21/1050 2026-08-20 14:54 by 昝占全2025
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +16 Ldrop2023 2026-08-13 20/1000 2026-08-20 11:07 by xskun
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +21 yaoyewhu2008 2026-08-20 21/1050 2026-08-20 10:37 by Vivilian
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +14 kkkl_v 2026-08-19 15/750 2026-08-20 08:21 by sunzitan
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 13/650 2026-08-19 21:28 by aasahr
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +4 yuleib84 2026-08-19 5/250 2026-08-19 19:52 by hhs666
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 什么时候开奖？ +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[论文投稿] 投稿咨询 +4 wwm09 2026-08-17 6/300 2026-08-18 15:36 by wwm09
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭