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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR ， 双酶切，连接问题
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

[求助] PCR ， 双酶切，连接问题

请问一下PCR用高保真的酶P 3000多的片段，突变率大吗？还有PCR 的目的片段纯化后，双酶切效果如何？把两个目的片段同时往载体上连的话，一个片段是3000bp，一个是2000bp，载体5380bp，用的是TAKARA的连接试剂盒，两个片段的合适比例是多少啊？
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
1楼 2011-08-27 11:09:59
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
1949stone(金币+3): 牛人 支持 想你学习 2011-08-27 21:23:18
引用回帖:
3楼: Originally posted by 青菜小虫 at 2011-08-27 14:53:25:
你说的Takara的primer star，我在Takara的目录上没有找到，能给我具体指一下名称吗？还有目的片段纯化后酶切为什么要加保护碱基？再麻烦你一下啦

1   PrimeSTAR HS DNA Polymerase是兼具高保真性和高扩增效率的PCR用DNA聚合酶。因其具有极强的3’→5’Exonuclease活性而显示出超群的校正功能，同时还具有优于Taq DNA Polymerase的高扩增效率。制品中添加了在常温状态下能够抑制DNA Polymerase活性及3’→5’Exonuclease活性的抗体，有效防止PCR反应前的引物错配和引物消化。与最适反应Buffer配合使用，可以实现对广泛靶序列的高保真性、高灵敏度、高特异性、高成功率的扩增，对于cDNA克隆等要求高保真的PCR反应发挥最强大的威力。使用本制品扩增得到的PCR产物几乎都为平滑末端，经磷酸化后可直接克隆于具有平滑末端的载体中。
2 GC含量高的话：
PrimeSTARHS DNA Polymerase with GC Buffer适用于高保真扩增具有复杂二级结构的DNA模板(GC rich、重复序列等)。PrimeSTARHS DNA Polymerase具有极强的3′→5′Exonuclease活性，显示出超群的校正功能，同时还具有优于Taq DNA Polymerase的高扩增效率。本制品对cDNA克隆等要求高保真的PCR反应能够发挥强大威力，并能对高GC含量模板进行高效扩增。使用本制品扩增得到的PCR产物几乎都为平滑末端，经磷酸化后可直接克隆于具有平滑末端的载体中。
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jiayoubashaonian
6楼2011-08-27 15:19:08
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

青菜小虫(金币+5): 谢谢你的解答。 2011-08-27 14:26:48
1949stone(MolEPI+1): 这个要epi 13k的 可以么？ 2011-08-27 21:22:53
我们实验室扩增长片段常用的是Takara的primer star，有记录的是7.3k。没错碱基，楼主可以试一下！目的片段纯化后如果量足够大，酶切也没问题的，别忘了加上保护碱基。两个大片段往载体上连接难度可能大些，但也能成功，曾经连接过14k，1k，700bp的和7.3k，3.8k，700bp的能连上但费了不少功夫！关于比例这个楼主最好咨询一下技术顾问，偶也没太多的经验，就是多做了些连接转化就搞定了！
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jiayoubashaonian
2楼2011-08-27 12:08:07
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-27 12:08:07:
我们实验室扩增长片段常用的是Takara的primer star，有记录的是7.3k。没错碱基，楼主可以试一下！目的片段纯化后如果量足够大，酶切也没问题的，别忘了加上保护碱基。两个大片段往载体上连接难度可能大些，但也能 ...

你说的Takara的primer star，我在Takara的目录上没有找到，能给我具体指一下名称吗？还有目的片段纯化后酶切为什么要加保护碱基？再麻烦你一下啦
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
3楼2011-08-27 14:53:25
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-27 12:08:07:
我们实验室扩增长片段常用的是Takara的primer star，有记录的是7.3k。没错碱基，楼主可以试一下！目的片段纯化后如果量足够大，酶切也没问题的，别忘了加上保护碱基。两个大片段往载体上连接难度可能大些，但也能 ...

如果酶切位点不是很靠边的话，是不是保护碱基也可以不用加？
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
4楼2011-08-27 14:57:28
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