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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于酶切的问题
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xingxing8713

银虫 (小有名气)

[求助] 关于酶切的问题

我现在要用Act，Ter，Puc57构建一个载体，酶切位点是HindIII，Sse8387I(即Sdal)，现在要把Act，Ter做双酶切，Puc57用HindIII酶切，问下50ul 酶切体系各组分多少合适，用什么酶和BUFFER啊？酶切之后，只有PUC57做去磷酸化吗？做连接时必须3片段同时连吗？
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1楼 2011-08-20 00:22:47
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yguang

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-08-20 09:43:09
做酶切要看你用的哪个公司的酶，根据那个公司酶的说明书来看用什么相应的buffer，酶切体系的组分要看你的DN2A浓度来定。去磷酸化无所谓（这个有些人可能有不同意见，我是自己做了10多年实验的经验，你如果不放心就做），连接时3个片段也可以同时连，我同时连过4个片段，关键要控制好各片段的比例。
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2楼2011-08-20 00:53:36
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xingxing8713

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by yguang at 2011-08-20 00:53:36:
做酶切要看你用的哪个公司的酶，根据那个公司酶的说明书来看用什么相应的buffer，酶切体系的组分要看你的DN2A浓度来定。去磷酸化无所谓（这个有些人可能有不同意见，我是自己做了10多年实验的经验，你如果不放心就 ...

为啥要去磷酸化呢

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2011-08-20 10:06:58
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

xingxing8713(金币+5): 谢谢你，请问可以都去磷酸化吗？ 2011-08-20 10:27:27
通常浓度的载体50ul体系双酶切，我们用2-2.5ul的酶，buffer与酶配套使用的。去磷酸化是为了防止单酶切后的载体自连，所以只有PUC57需要做去磷酸化。
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
4楼2011-08-20 10:18:37
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xingxing8713

银虫 (小有名气)
可以都去磷酸化吗？
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5楼2011-08-20 10:28:02
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

去磷酸化只是为了防止切开后自己又连上，双酶切的产物粘性末端一般不是相同的，就没必要去磷酸化。
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
6楼2011-08-20 18:53:28
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