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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 反向PCR求助！
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hnndpt

铁虫 (正式写手)

[求助] 反向PCR求助！

最近在做反向PCR, 酶切后取8微升，用400微升体系连接。但连接完毕沉淀，离心后没有发现任何东西？请问是什么原因造成的？
1.我用的内切酶为 Hae111, 识别4个碱基，平末端；；
2.另外用了 PVUII,   MSP1， Mbol
3.我的目的基因中没有合适的酶切位点，请问可以选用一些基因中没有的酶切位点吗？

此外求助大家做反向PCR的体系，非常感谢！！！
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1楼2011-08-15 20:30:54
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-08-15 21:23:53
hnndpt(金币+1): 2011-08-17 16:03:15
连接后沉淀？ 这什么连接体系啊
如果知道目的基因的碱基序列可以用软件分析一下酶切位点，基因中没有的酶切位点，你用酶都识别不了，怎么切得下来呢。 一般是在PCR引物两段添加酶切位点，这样酶切连接就方便了。
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
2楼2011-08-15 20:43:47
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-08-15 21:23:59
hnndpt(金币+1): 2011-08-17 16:03:22
不知楼主有多少样品，多的话建议楼主用TAIL PCR，我们实验室的效率做的在60%左右，刘耀光老师的2007年文章有介绍！
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jiayoubashaonian
3楼2011-08-15 20:55:00
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-15 20:55:00:
不知楼主有多少样品，多的话建议楼主用TAIL PCR，我们实验室的效率做的在60%左右，刘耀光老师的2007年文章有介绍！

我就有一个样品，就是做的过程中会出问题，没有回收到连接产物！
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4楼2011-08-15 21:26:42
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xbl3688 at 2011-08-15 20:43:47:
连接后沉淀？ 这什么连接体系啊
如果知道目的基因的碱基序列可以用软件分析一下酶切位点，基因中没有的酶切位点，你用酶都识别不了，怎么切得下来呢。 一般是在PCR引物两段添加酶切位点，这样酶切连接就方便了。

谢谢，我做的是反向PCR!
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5楼2011-08-15 21:27:44
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by hnndpt at 2011-08-15 21:26:42:
我就有一个样品，就是做的过程中会出问题，没有回收到连接产物！

反向本来就很难做的，建议楼主多试几种方法和几种酶！
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jiayoubashaonian
6楼2011-08-15 21:29:06
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): Good! 2011-08-16 11:34:10
引用回帖:
6楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-15 21:29:06:
反向本来就很难做的，建议楼主多试几种方法和几种酶！

或者试着用一下TAIL PCR，实在不行基因组序列小的话可以测序！
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jiayoubashaonian
7楼2011-08-15 21:33:06
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Silencess

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

hnndpt(金币+8): 2011-08-24 21:32:08
我做反向PCR的时候没有沉淀这一步啊。。。沉淀是干嘛。。
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繁花似錦，年華散盡。
8楼2011-08-24 09:47:24
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Silencess at 2011-08-24 09:47:24:
我做反向PCR的时候没有沉淀这一步啊。。。沉淀是干嘛。。

我做反向PCR的步骤：
1.提取基因组，HaeIII酶切过夜
2.酚-氯仿 抽提酶切产物，沉淀DNA,用20微升水溶解
3.取4微升 溶解过的DNA, 加入连接酶，用400微升体系连接
4.酚-氯仿 抽提连接产物，无水乙醇沉淀DNA, 用20微升水溶解
5.取 2 微升连接后溶解的产物 做PCR

请问，这些步骤有哪些和您的不一样？可以优化吗？
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9楼2011-08-24 21:36:56
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longage.gene

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by hnndpt at 2011-08-24 21:36:56:
我做反向PCR的步骤：
1.提取基因组，HaeIII酶切过夜
2.酚-氯仿 抽提酶切产物，沉淀DNA,用20微升水溶解
3.取4微升 溶解过的DNA, 加入连接酶，用400微升体系连接
4.酚-氯仿 抽提连接产物，无水乙醇沉淀DNA, 用 ...

为什么要酶切后又连接？为什么不可以直接p？
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10楼2011-08-25 08:41:27
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