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Silencess

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 热心哦 2011-08-25 18:34:06
wanhscn(MolEPI+1): 谦虚！热心！专业！经决定，给与一个专家指数！ 2011-10-22 10:32:40

引用回帖:

9楼: Originally posted by hnndpt at 2011-08-24 21:36:56:
我做反向PCR的步骤：
1.提取基因组，HaeIII酶切过夜
2.酚-氯仿抽提酶切产物，沉淀DNA,用20微升水溶解
3.取4微升溶解过的DNA, 加入连接酶，用400微升体系连接
4.酚-氯仿抽提连接产物，无水乙醇沉淀DNA, 用 ...

提取基因组之后，测浓度，酶切过夜。
切胶回收，试剂盒纯化，测浓度。
100ul体系连接，一般好像是加入200ng左右的酶切片段。16度环化过夜。
我在环化之后就直接做PCR了。
环化的时候家的DNA的量要少。
还有就是酶切的基因组纯度要高。多设计几对引物吧。

弱弱的问一句，你用反向pcr扩增什么呢，这个确实不好做啊。

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繁花似錦，年華散盡。

11楼2011-08-25 11:22:33

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huchuanlu5

银虫 (小有名气)

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★ ★
dhd997(金币+2): 顶贴很活跃啊，欢迎交流 2011-08-30 18:40:53

引用回帖:

10楼: Originally posted by longage.gene at 2011-08-25 08:41:27:
为什么要酶切后又连接？为什么不可以直接p？

酶切后要连接形成环，然后才可以进行反向PCR,可以看看反向PCR原理

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12楼2011-08-30 17:28:23

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hnndpt

铁虫 (正式写手)

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引用回帖:

11楼: Originally posted by Silencess at 2011-08-25 11:22:33:
提取基因组之后，测浓度，酶切过夜。
切胶回收，试剂盒纯化，测浓度。
100ul体系连接，一般好像是加入200ng左右的酶切片段。16度环化过夜。
我在环化之后就直接做PCR了。
环化的时候家的DNA的量要少。
还有 ...

调一个基因的启动子，反向做了一次，没扩出来，老板又给安排别的实验，被迫中断，现在又开始了，被折腾的很无奈！

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13楼2011-10-21 20:11:51

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