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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 反向PCR求助！
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Silencess

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 热心哦 2011-08-25 18:34:06
wanhscn(MolEPI+1): 谦虚！热心！专业！经决定，给与一个专家指数！ 2011-10-22 10:32:40
引用回帖:
9楼: Originally posted by hnndpt at 2011-08-24 21:36:56:
我做反向PCR的步骤：
1.提取基因组，HaeIII酶切过夜
2.酚-氯仿 抽提酶切产物，沉淀DNA,用20微升水溶解
3.取4微升 溶解过的DNA, 加入连接酶，用400微升体系连接
4.酚-氯仿 抽提连接产物，无水乙醇沉淀DNA, 用 ...

提取基因组之后，测浓度，酶切过夜。
切胶回收，试剂盒纯化，测浓度。
100ul体系连接，一般好像是加入200ng左右的酶切片段。16度环化过夜。
我在环化之后就直接做PCR了。
环化的时候家的DNA的量要少。
还有就是酶切的基因组纯度要高。多设计几对引物吧。

弱弱的问一句，你用反向pcr扩增什么呢，这个确实不好做啊。
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繁花似錦，年華散盡。
11楼2011-08-25 11:22:33
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huchuanlu5

银虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): 顶贴很活跃啊，欢迎交流 2011-08-30 18:40:53
引用回帖:
10楼: Originally posted by longage.gene at 2011-08-25 08:41:27:
为什么要酶切后又连接？为什么不可以直接p？

酶切后要连接形成环，然后才可以进行反向PCR,可以看看反向PCR原理
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2011-08-30 17:28:23
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by Silencess at 2011-08-25 11:22:33:
提取基因组之后，测浓度，酶切过夜。
切胶回收，试剂盒纯化，测浓度。
100ul体系连接，一般好像是加入200ng左右的酶切片段。16度环化过夜。
我在环化之后就直接做PCR了。
环化的时候家的DNA的量要少。
还有 ...

调一个基因的启动子，反向做了一次，没扩出来，老板又给安排别的实验，被迫中断，现在又开始了，被折腾的很无奈！
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13楼2011-10-21 20:11:51
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wyue-8461

铜虫 (初入文坛)
一系列步骤下来是不是DNA浓度太低了？
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14楼2011-10-31 19:02:49
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dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫
楼主 现在反向PCR的结果怎么样了啊，我也在尝试着做呢，做了很多次了，都没有结果。楼主成功了的话，我们可以交流交流
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好好学习，天天向上
15楼2013-04-26 08:12:33
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