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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆假阳性的问题
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asdfghjkl-00

新虫 (初入文坛)

[求助] 克隆假阳性的问题

最近一直在做克隆，蓝白筛选长的白斑也不少，送去测序也有系列，但是一比对，就是载体序列，请问这是怎么回事啊？是阳性率太低了吗？是不是连接效率太低导致的阳性率也低？怎么提高连接效率啊？各位高手们帮忙解决一下吧。。。。

[ Last edited by asdfghjkl-00 on 2011-7-31 at 10:10 ]
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1楼 2011-07-31 10:05:51
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healerly

禁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 非常热心，破格奖励 2011-07-31 17:51:27
既然有蓝白色菌斑，说明可以转进质粒去。测序不成功，结果是空载体说明是假阳性。楼主是不是用的试剂盒？现在试剂盒载体自连的概率是很小的。
问题1：楼主不进行白色菌斑的PCR鉴定以及双酶切鉴定吗？
问题2：楼主的目的片段是多少？连接多少时间？
建议：1，在测序之前进行阳性菌株的鉴定。
      2，如果是长片段的话，建议连接过夜，可以提高连接效率。
希望楼主尽快找到问题~~实验顺利
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heal the world！！！
2楼2011-07-31 15:20:11
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mayonghong

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
1949stone(金币+3): 学习下 2011-07-31 20:47:23
在测序前建议先进行菌液PCR进行验证，但是有的时候菌液PCR容易假阳性，也可以提质粒，电泳进行验证，现在酶连都是试剂盒，我们一般酶连时间：16℃酶连4h，或者4℃酶连过夜，还有酶连时间也不是越长越好，另外做实验室实验手法也很重要，一定要注意细节问题。
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一生有你
3楼2011-07-31 20:28:01
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gwbk

木虫 (正式写手)
问一个比较弱的问题，载体是什么？宿主是什么？有蓝斑吗？
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4楼2011-07-31 22:47:52
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