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追寻风轻扬

金虫 (小有名气)

[求助] 重叠延伸 ，为什么用连接后的片段作为模板却扩不出来？

烦请各位帮帮忙   两个外显子  200bp 和1000bp的  重叠延伸pcr扩出1200的  胶回收后  用1200的作为模板  却扩不出来了     而且还有一条250左右的片段  为什么啊 ？问题可能出在哪儿呢？
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幸福只道是寻常
1楼 2011-07-22 22:37:44
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 又是一位有经验的高手！ 2011-08-16 11:43:40
个人觉得直接融合基因直接连T载体，然后去测序。
因为overlap大小拼上了，也不代表就是目的基因，或者不确定是怎么个拼上了，或者有点突变恰好是在引物3·端……
做过不少overlap，测序结果出来后，有不少都不是你设计的那回事。
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8楼2011-08-16 11:04:38
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普通回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-24 09:13:01
PCR扩不出来，可以降低退火温度试试。
不过如果用原来扩增200bp和1000bp的引物来扩1200bp的引物，一般比较难，原理我不记得了。
我们一般这样子做：当初扩你那两个片段的时候（姑且称为A片段和B片段，A在左B在右），A的左端和B的右端额外多扩几个到几十个碱基；另外再设计一对嵌套引物，位点就在你需要的A的左端和B的右端，用它来扩增融合产物，得到你真正需要的产物。一句话，就是融合时使得融合产物比想要的产物长一点，之后再用一对新的引物把目的产物P出来。
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2楼2011-07-23 17:10:54
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追寻风轻扬

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-07-23 17:10:54:
PCR扩不出来，可以降低退火温度试试。
不过如果用原来扩增200bp和1000bp的引物来扩1200bp的引物，一般比较难，原理我不记得了。
我们一般这样子做：当初扩你那两个片段的时候（姑且称为A片段和B片段，A在左B在右 ...

谢谢！但是我已经连接得到1200大小的片段了，只是用1200的再作为模板就扩不出来了。难道那1200左右的片段不是我要的，而是错配扩出来的？还是两端引物的问题？在A和B的外侧再多出一些片段可以起到什么作用啊？谢谢啦.
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幸福只道是寻常
3楼2011-07-26 22:12:13
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cloverplm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-07-30 23:33:59
引用回帖:
Originally posted by 追寻风轻扬 at 2011-07-26 22:12:13:
谢谢！但是我已经连接得到1200大小的片段了，只是用1200的再作为模板就扩不出来了。难道那1200左右的片段不是我要的，而是错配扩出来的？还是两端引物的问题？在A和B的外侧再多出一些片段可以起到什么作用啊？ ...

PCR扩增有1%的突变率，也有可能是你扩增的片段突变了。
引物的问题也不能排除。
在两端再加一些片段能保证扩增方向以及减少扩增过程中的错配。
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净——静——竞——进
4楼2011-07-26 22:44:54
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brennan

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

这个问题我也遇到过，用扩出来的融合产物再去扩就是没办法扩出来。各种条件都换过了，最后还是没有p出来，还做过巢式PCR，目的产物肯定是没有错的，但是以它为模板为什么p不出就不知道了
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5楼2011-07-30 17:57:50
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 追寻风轻扬 at 2011-07-26 22:12:13:
谢谢！但是我已经连接得到1200大小的片段了，只是用1200的再作为模板就扩不出来了。难道那1200左右的片段不是我要的，而是错配扩出来的？还是两端引物的问题？在A和B的外侧再多出一些片段可以起到什么作用啊？谢 ...

原因可能是酶需要额外的序列以结合到模板上吧，不清楚……
不过普通PCR之后拿产物做模板再P，倒是不难P出来，就是融合PCR这样做很难，原理我不懂哦
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6楼2011-08-16 00:17:36
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小七咯

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 有经验哦！你的意思是用4条引物同时做PCR？ 2011-08-16 11:43:13
这个我遇到过，不过后来解决了。就是把两个片段重叠部分的引物也加进去一起跑，而且，模版量也要摸。还有一个方法，就是直接把两个片段继续重叠啊，一直重叠到你需要的量为止。还有一个问题，那就是你回收的量有多大，够不够的？
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7楼2011-08-16 10:56:56
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 欢迎交流。不知道你们用的是什么酶？我们这样子做很难做出来…… 2011-08-16 11:44:06
上下游引物直接放进去，一次PCR搞定，重叠延伸的模版量一定要大，10ng以上～～
基本没啥问题
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9楼2011-08-16 11:05:12
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 谢谢~ 2011-08-18 01:26:11
东洋纺的kod plus～～
应该不难出来吧，只要是高保真酶，应该都差不多呀，就是模版量一定要大，我是回收产物直接各上样3ul～～
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10楼2011-08-16 17:38:55
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