应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠延伸 ，为什么用连接后的片段作为模板却扩不出来？
51/1返回列表
查看: 1556  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

追寻风轻扬

金虫 (小有名气)

[求助] 重叠延伸 ，为什么用连接后的片段作为模板却扩不出来？

烦请各位帮帮忙   两个外显子  200bp 和1000bp的  重叠延伸pcr扩出1200的  胶回收后  用1200的作为模板  却扩不出来了     而且还有一条250左右的片段  为什么啊 ？问题可能出在哪儿呢？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
幸福只道是寻常
1楼 2011-07-22 22:37:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 追寻风轻扬 at 2011-07-26 22:12:13:
谢谢！但是我已经连接得到1200大小的片段了，只是用1200的再作为模板就扩不出来了。难道那1200左右的片段不是我要的，而是错配扩出来的？还是两端引物的问题？在A和B的外侧再多出一些片段可以起到什么作用啊？谢 ...

原因可能是酶需要额外的序列以结合到模板上吧，不清楚……
不过普通PCR之后拿产物做模板再P，倒是不难P出来，就是融合PCR这样做很难，原理我不懂哦
赞一下 回复此楼
6楼2011-08-16 00:17:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-24 09:13:01
PCR扩不出来，可以降低退火温度试试。
不过如果用原来扩增200bp和1000bp的引物来扩1200bp的引物，一般比较难，原理我不记得了。
我们一般这样子做：当初扩你那两个片段的时候（姑且称为A片段和B片段，A在左B在右），A的左端和B的右端额外多扩几个到几十个碱基；另外再设计一对嵌套引物，位点就在你需要的A的左端和B的右端，用它来扩增融合产物，得到你真正需要的产物。一句话，就是融合时使得融合产物比想要的产物长一点，之后再用一对新的引物把目的产物P出来。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-07-23 17:10:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

追寻风轻扬

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-07-23 17:10:54:
PCR扩不出来，可以降低退火温度试试。
不过如果用原来扩增200bp和1000bp的引物来扩1200bp的引物，一般比较难，原理我不记得了。
我们一般这样子做：当初扩你那两个片段的时候（姑且称为A片段和B片段，A在左B在右 ...

谢谢！但是我已经连接得到1200大小的片段了，只是用1200的再作为模板就扩不出来了。难道那1200左右的片段不是我要的，而是错配扩出来的？还是两端引物的问题？在A和B的外侧再多出一些片段可以起到什么作用啊？谢谢啦.
赞一下 回复此楼
幸福只道是寻常
3楼2011-07-26 22:12:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cloverplm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-07-30 23:33:59
引用回帖:
Originally posted by 追寻风轻扬 at 2011-07-26 22:12:13:
谢谢！但是我已经连接得到1200大小的片段了，只是用1200的再作为模板就扩不出来了。难道那1200左右的片段不是我要的，而是错配扩出来的？还是两端引物的问题？在A和B的外侧再多出一些片段可以起到什么作用啊？ ...

PCR扩增有1%的突变率，也有可能是你扩增的片段突变了。
引物的问题也不能排除。
在两端再加一些片段能保证扩增方向以及减少扩增过程中的错配。
赞一下(1人) 回复此楼
净——静——竞——进
4楼2011-07-26 22:44:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 301求调剂 +4 A_JiXing 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:32 by ruiyingmiao
[考研] 341求调剂 +5 捣蛋猪猪 2026-03-11 6/300 2026-03-17 17:16 by ruiyingmiao
[考研] 化学工程321分求调剂 +11 大米饭！ 2026-03-15 14/700 2026-03-17 17:11 by ruiyingmiao
[考研] 有没有道铁/土木的想调剂南林，给自己招师弟中～ +3 TqlXswl 2026-03-16 7/350 2026-03-17 15:23 by TqlXswl
[考研] 一志愿苏州大学材料工程（085601）专硕有科研经历三项国奖两个实用型专利一项省级立项 +6 大火山小火山 2026-03-16 8/400 2026-03-17 15:05 by 无懈可击111
[考研] 0854可跨调剂，一作一项核心论文五项专利，省、国级证书40+数一英一287 +3 小李0854 2026-03-16 3/150 2026-03-17 13:40 by 热情沙漠
[考博] 26申博 +4 八旬速览 2026-03-16 4/200 2026-03-17 13:00 by 轻松不少随
[考研] 304求调剂 +3 曼殊2266 2026-03-14 3/150 2026-03-16 16:39 by houyaoxu
[考研] 321求调剂 +5 大米饭！ 2026-03-15 5/250 2026-03-16 16:33 by houyaoxu
[考研] 材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐 +7 Ncdx123456 2026-03-13 8/400 2026-03-16 12:15 by karry wen
[考研] 复试调剂 +4 z1z2z3879 2026-03-14 5/250 2026-03-14 16:30 by JourneyLucky
[考研] 297求调剂 +4 学海漂泊 2026-03-13 4/200 2026-03-14 11:51 by 热情沙漠
[考研] 材料371求调剂 +9 鳄鱼? 2026-03-11 11/550 2026-03-13 22:53 by JourneyLucky
[考研] 求调剂（材料与化工327） +4 爱吃香菜啦 2026-03-11 4/200 2026-03-13 22:11 by JourneyLucky
[考研] 四川大学085601材料工程专硕 初试294求调剂 +4 祝我们好在冬天 2026-03-11 4/200 2026-03-13 21:39 by peike
[考研] （081700）化学工程与技术-298分求调剂 +12 11啦啦啦 2026-03-11 35/1750 2026-03-13 21:25 by JourneyLucky
[考研] 301求调剂 +6 Liyouyumairs 2026-03-11 6/300 2026-03-13 20:11 by JourneyLucky
[考研] 0703化学求调剂 +7 绿豆芹菜汤 2026-03-12 7/350 2026-03-13 17:25 by njzyff
[考研] 310求调剂 +3 【上上签】 2026-03-11 3/150 2026-03-13 16:16 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +3 程雨杭 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:06 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭