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追寻风轻扬

金虫 (小有名气)

[求助] 重叠延伸 ,为什么用连接后的片段作为模板却扩不出来?

烦请各位帮帮忙   两个外显子  200bp 和1000bp的  重叠延伸pcr扩出1200的  胶回收后  用1200的作为模板  却扩不出来了     而且还有一条250左右的片段  为什么啊 ?问题可能出在哪儿呢?
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幸福只道是寻常
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cloverplm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励 2011-07-30 23:33:59
引用回帖:
Originally posted by 追寻风轻扬 at 2011-07-26 22:12:13:
谢谢!但是我已经连接得到1200大小的片段了,只是用1200的再作为模板就扩不出来了。难道那1200左右的片段不是我要的,而是错配扩出来的?还是两端引物的问题?在A和B的外侧再多出一些片段可以起到什么作用啊? ...

PCR扩增有1%的突变率,也有可能是你扩增的片段突变了。
引物的问题也不能排除。
在两端再加一些片段能保证扩增方向以及减少扩增过程中的错配。
净——静——竞——进
4楼2011-07-26 22:44:54
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查看全部 13 个回答

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-24 09:13:01
PCR扩不出来,可以降低退火温度试试。
不过如果用原来扩增200bp和1000bp的引物来扩1200bp的引物,一般比较难,原理我不记得了。
我们一般这样子做:当初扩你那两个片段的时候(姑且称为A片段和B片段,A在左B在右),A的左端和B的右端额外多扩几个到几十个碱基;另外再设计一对嵌套引物,位点就在你需要的A的左端和B的右端,用它来扩增融合产物,得到你真正需要的产物。一句话,就是融合时使得融合产物比想要的产物长一点,之后再用一对新的引物把目的产物P出来。
2楼2011-07-23 17:10:54
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追寻风轻扬

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-07-23 17:10:54:
PCR扩不出来,可以降低退火温度试试。
不过如果用原来扩增200bp和1000bp的引物来扩1200bp的引物,一般比较难,原理我不记得了。
我们一般这样子做:当初扩你那两个片段的时候(姑且称为A片段和B片段,A在左B在右 ...

谢谢!但是我已经连接得到1200大小的片段了,只是用1200的再作为模板就扩不出来了。难道那1200左右的片段不是我要的,而是错配扩出来的?还是两端引物的问题?在A和B的外侧再多出一些片段可以起到什么作用啊?谢谢啦.
幸福只道是寻常
3楼2011-07-26 22:12:13
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brennan

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

这个问题我也遇到过,用扩出来的融合产物再去扩就是没办法扩出来。各种条件都换过了,最后还是没有p出来,还做过巢式PCR,目的产物肯定是没有错的,但是以它为模板为什么p不出就不知道了
5楼2011-07-30 17:57:50
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