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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量需要3个重复样本吗
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lixiaojing1318

银虫 (小有名气)

[交流] 荧光定量需要3个重复样本吗 已有8人参与

荧光定量需要3个重复样本吗，还是只要一个样品，做3个重复？
提完RNA后，需要定量到相同浓度吗？
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1楼 2011-07-19 09:07:53
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

shaquila

金虫 (正式写手)
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西瓜(金币+5, EPI+1): 学习了！ 2011-07-19 16:25:52
你说的是biological replicate 和 technical replicate，一般每个样本做三到四个技术重复，这个貌似是荧光定量必需的
生物学重复就是可以独立重复提取两三次，分别进行实验，荧光定量最好需要生物学重复～～
另外RNA量最好定在一个范围里面，虽然有内参基因校正，但是大部分综述推荐，这样好调整模版量，并且由于是扩增反应，在2ΔΔct如果扩增效率不平行，很可能误差会放大，因此ΔΔct也最好都做个标准曲线，样品浓度最好在标准曲线范围内。
摘自google～
A technical replicate involves the multiple labeling or reciprocal labeling of the same RNA sample. The purpose of a technical replicate is to control for technical variability within an experiment (array to array variation, reagent variation, dye incorporation, etc.) A well run experiment should have minimal variation thus minimizing the need for technical replicates.
A biological replicate involves isolating RNA independently from replicate sources (multiple cell lines, multiple biopsies, multiple patients, etc). The purpose of a biological replicate is to control for biological diversity. Biological replicates are often more telling, and for this reason are “better” than technical replicates, however, biological replicates are often more difficult to obtain

[ Last edited by shaquila on 2011-7-19 at 13:47 ]
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3楼2011-07-19 13:09:50
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daizi368

铜虫 (小有名气)
★
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1、楼主做基因在不同时期样品的表达量，如果是每一组（就是每个时期）包括 几个样品（我们一般做5个），那就完全不需要重复。
2、我们发文章时QRT的数据从来只show最终相对数据（用柱状图或曲线图）
3、溶解曲线还是可以的，做成这样数据已经比较可信了
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10楼2011-08-01 09:25:03
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足下客

木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+2): good 2011-07-19 12:52:45
不太明白你问的问题的意思。一般来讲荧光定量每个样本都要做3个孔，这是严格来讲。不管是测RNA还是DNA当然要把浓度调成一样的，要不然这个定量就没有什么意义了。不知道你具体是做什么实验，想达到什么目的。
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2楼2011-07-19 12:45:27
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lixiaojing1318

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-07-19 13:09:50:
你说的是biological replicate 和 technical replicate，一般每个样本做三到四个技术重复，这个貌似是荧光定量必需的
生物学重复就是可以独立重复提取两三次，分别进行实验，荧光定量最好需要生物学重复～～
另 ...

您说的RNA定在一定的浓度范围内，这个大概是相差多少为好呢
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4楼2011-07-20 22:08:45
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lixiaojing1318

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lixiaojing1318 at 2011-07-20 22:08:45:
您说的RNA定在一定的浓度范围内，这个大概是相差多少为好呢

我是才开始准备做荧光定量，先做了个普通PCR，发现有引物二聚体存在，该怎么消除呢
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5楼2011-07-20 22:11:13
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
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1949stone(金币+1): 鼓励西瓜 2011-07-31 18:04:46
引用回帖:
Originally posted by lixiaojing1318 at 2011-07-20 22:11:13:
我是才开始准备做荧光定量，先做了个普通PCR，发现有引物二聚体存在，该怎么消除呢

可以提高退火温度以增强特异性，你看看用的酶推荐的退火温度最高是多少就用多少。
不知道你用的是两步法还是三步法，三步法（传统的变性、退火、延伸三步）特异性更好。
上面两个方法都不行的话，考虑重新设计引物。
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6楼2011-07-21 11:45:06
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shaquila

金虫 (正式写手)
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西瓜(金币+1): 热心 2011-07-23 17:34:54
引用回帖:
Originally posted by lixiaojing1318 at 2011-07-20 22:08:45:
您说的RNA定在一定的浓度范围内，这个大概是相差多少为好呢

可以按照反转试剂盒里面的推荐用量，大体上一致即可～
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7楼2011-07-23 11:41:45
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lixiaojing1318

银虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励一下 2011-07-30 13:14:04
引用回帖:
Originally posted by 足下客 at 2011-07-19 12:45:27:
不太明白你问的问题的意思。一般来讲荧光定量每个样本都要做3个孔，这是严格来讲。不管是测RNA还是DNA当然要把浓度调成一样的，要不然这个定量就没有什么意义了。不知道你具体是做什么实验，想达到什么目的。

您好，我是做基因在不同时期样品的表达量，做的是相对定量。还有一些问题，最近小木虫修复，一直没有机会问。
1.由于我是要做多个样品，扩增效率该怎么得到？还是每个样都需要做标准曲线？
2.做完了实验，所得到的扩增曲线和溶解曲线，是不是都得单独保存?发文章时会都用到吗，还是只需要几个图就可以了？
下面是扩增曲线和溶解曲线的图，是不是CT值在30以上就不可以用？
还有溶解曲线前面有峰，是不是有引物二聚体？
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8楼2011-07-30 11:15:01
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保护你的大树

新虫 (小有名气)
★
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如果你只有两个重复，而两个重复结果相差结果有点大，你就不知道选哪个比较好，而三个重复如果出现这种情况就可以去掉一个相差比较远的结果，三个以上选择当然会更多，所以底线是三个，
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9楼2011-07-31 10:25:24
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