| 查看: 5644 | 回复: 18 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
yanhui8558金虫 (小有名气)
|
[求助]
his标签蛋白纯化，不挂柱 已有1人参与
|
||
我一直在用大肠杆菌表达一个蛋白激酶，用pet21a载体，用过超声破碎和先溶菌酶处理和超声处理破碎。结果蛋白主要在沉淀中，上清中的量不多但还可以，主要问题是不怎么挂镍柱，用PBS平衡柱子，PH8.0, 30mM咪唑洗杂蛋白，250mM咪唑洗脱，跑蛋白电泳和western都是穿过液和上清条带都差不多，很苦恼， 有没有高人指点一下啊。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 蛋白质生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
梦想
已经有7人回复
-
学科评审组评审是指会评吗？
已经有4人回复
-
面上合作单位盖章
已经有8人回复
-
面上函评意见出来了，像什么等级？
已经有15人回复
-
为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难
已经有14人回复
-
小白求助 投论文要求的highlights应该如何写
已经有4人回复
-
麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上）
已经有12人回复
-
怎么看青基中了没有啊
已经有6人回复
-
国社科又开始会评了，不知道这次命运如何
已经有11人回复
-
有多少人是今天查系统知道结果的？
已经有19人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 组氨酸标签重组蛋白纯化
已经有10人回复
- 如何在蛋白纯化后去除6组氨酸(6His)标签
已经有17人回复
- gst标签蛋白的表达和纯化
已经有17人回复
- 关于带his-tag的膜蛋白镍柱纯化
已经有10人回复
- 蛋白纯化问题
已经有13人回复
- 镍柱纯化蛋白透析出现大量沉淀，请教
已经有18人回复
- gst标签，蛋白纯化
已经有25人回复
- Ni柱分离纯化6His标签重组蛋白
已经有23人回复
- 【求助/交流】his标签蛋白纯化
已经有12人回复
- 【求助/交流】关于his-tagged 蛋白纯化
已经有9人回复
- 【求助/交流】为什么镍柱纯化可溶性蛋白，电泳结果总是显示不纯呢？
已经有9人回复
- 【求助/交流】带GST标签的重组蛋白的纯化？
已经有14人回复
- 【求助/交流】蛋白不挂柱怎么办
已经有11人回复
- 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
已经有26人回复
【答案】应助回帖
★ ★ ★
yanhui8558(金币+2): 2011-07-14 17:02:13
lstt09nk(金币+3): 辛苦，感谢交流，欢迎常来 2011-07-17 20:22:27
yanhui8558(金币+2): 2011-07-14 17:02:13
lstt09nk(金币+3): 辛苦，感谢交流，欢迎常来 2011-07-17 20:22:27
|
The reasons may be: • Elution conditions are too mild (histidine-tagged protein still bound): Elute with an increasing imidazole gradient or decreasing pH to determine the optimal elution conditions. • The protein has precipitated in the column: Try detergents or changed NaCl concentration or elute under denaturing (unfolding) conditions (use 4–8 M urea or 4–6 M Gua-HCl) to remove precipitated proteins. For the next experiment, decrease amount of sample, or decrease protein concentration by eluting with a linear imidazole gradient instead of imidazole steps. • Nonspecific hydrophobic or other interaction: Add a nonionic detergent to the elution buffer (e.g. 0.2% Triton X-100) or change the NaCl concentration. • Concentration of imidazole in the sample and/or binding buffer is too high: The protein is found in the flowthrough material. Decrease the imidazole concentration. • Target protein may not be histidine-tagged as expected: Verify DNA sequence of the gene. Analyze samples taken before and after induction of expression with, for example, anti-His antibodies in Western blotting. • Histidine-tag may be insufficiently exposed: The protein is found in the flowthrough material. Perform purification of unfolded protein in urea or Gua-HCl as for inclusion bodies. |
5楼2011-07-14 16:44:28
zx1984
木虫 (正式写手)
- 应助: 21 (小学生)
- 金币: 7212.2
- 散金: 2765
- 红花: 2
- 帖子: 438
- 在线: 401.2小时
- 虫号: 1176692
- 注册: 2010-12-24
- 性别: GG
- 专业: 出血、凝血与血栓
2楼2011-07-11 19:13:05
nnxqwei
至尊木虫 (职业作家)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 贵宾: 0.01
- 金币: 45861.4
- 散金: 66
- 红花: 110
- 帖子: 4849
- 在线: 784.1小时
- 虫号: 50626
- 注册: 2004-07-13
- 性别: GG
- 专业: 微生物学
3楼2011-07-12 03:21:44
4楼2011-07-14 10:27:08
20
投票:
