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yanhui8558金虫 (小有名气)
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his标签蛋白纯化，不挂柱 已有1人参与
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我一直在用大肠杆菌表达一个蛋白激酶，用pet21a载体，用过超声破碎和先溶菌酶处理和超声处理破碎。结果蛋白主要在沉淀中，上清中的量不多但还可以，主要问题是不怎么挂镍柱，用PBS平衡柱子，PH8.0, 30mM咪唑洗杂蛋白，250mM咪唑洗脱，跑蛋白电泳和western都是穿过液和上清条带都差不多，很苦恼， 有没有高人指点一下啊。 |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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nnxqwei
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【答案】应助回帖
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yanhui8558(金币+2): 2011-07-14 17:02:13
lstt09nk(金币+3): 辛苦，感谢交流，欢迎常来 2011-07-17 20:22:27
yanhui8558(金币+2): 2011-07-14 17:02:13
lstt09nk(金币+3): 辛苦，感谢交流，欢迎常来 2011-07-17 20:22:27
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The reasons may be: • Elution conditions are too mild (histidine-tagged protein still bound): Elute with an increasing imidazole gradient or decreasing pH to determine the optimal elution conditions. • The protein has precipitated in the column: Try detergents or changed NaCl concentration or elute under denaturing (unfolding) conditions (use 4–8 M urea or 4–6 M Gua-HCl) to remove precipitated proteins. For the next experiment, decrease amount of sample, or decrease protein concentration by eluting with a linear imidazole gradient instead of imidazole steps. • Nonspecific hydrophobic or other interaction: Add a nonionic detergent to the elution buffer (e.g. 0.2% Triton X-100) or change the NaCl concentration. • Concentration of imidazole in the sample and/or binding buffer is too high: The protein is found in the flowthrough material. Decrease the imidazole concentration. • Target protein may not be histidine-tagged as expected: Verify DNA sequence of the gene. Analyze samples taken before and after induction of expression with, for example, anti-His antibodies in Western blotting. • Histidine-tag may be insufficiently exposed: The protein is found in the flowthrough material. Perform purification of unfolded protein in urea or Gua-HCl as for inclusion bodies. |
5楼2011-07-14 16:44:28
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