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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助】基因克隆T载体酶切问题等
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happywoheni

铁虫 (小有名气)

[求助] 【求助】基因克隆T载体酶切问题等

求助啊，本人纯属菜鸟，问题较多，请大家帮帮忙！
1：引物中添加的限制性酶切位点是选择T载体上有的还是没有的？完全不懂！
2：我做基因克隆，用的上游引物5‘加了BamH1酶切位点，下游引物5’加了EcoR1酶切位点,可以用宝生物的pmD-19 T载体吗？
3：我现在做pcr产物的纯化，想问一下，下一步T载体和pcr产物都要经过双酶切之后，再连接吗？还是T载体可以不用双酶切，只是pcr产物双酶切？还是其他？
4：pcr产物可以直接双酶切吗，酶切缓冲液用哪一种，温度一个是30度一个是37度。
5：如果T载体不用酶切，直接连，酶切鉴定作用是什么？怎么做？用这两种限制性内切酶切吗？切完之后是不是有很多段？
5：蓝白斑筛选操作步骤

在线等，急……
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【分子生物】EPI帖

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1楼 2011-07-06 20:12:08
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 果断EPI 2011-07-06 23:20:43
引物中选择的酶切位点最好是在T载体上没有的，因为T载体连接上外源片段，验证正确之后，要双酶切质粒后跑电泳来回收外源片段。如果载体上有你设定的酶切位点，那么双酶切之后就不是只有载体和外源片段两条带了，但是如果你能保证不干扰你要回收的外源片段，双酶切之后你的外源片段还是能与其它条带分开，那么就没关系。
BamH1和EcoR1都是很常用的酶，一般载体上都有的，依照我上面说过的，只要能保证效果就可以。但是如果两个酶切位点相距太近，第一个酶切了之后第二个酶会结合不上去的。
T载体和PCR产物的连接不用双酶切，因为T-A连接是利用Taq酶在PCR产物3'末端有加上一个A的特性，使得Taq酶的PCR产物或经过Taq酶加A的PCR产物，和一个人工加上一个3'末端具有1个T的载体进行连接，由于突出末端可以互补，所以不用再进行其它酶切就能连接。
pcr产物最好别直接双酶切吗，经过回收之后再双酶切，体系里的其它物质会少一些，但是你的第三个问题解决了，这第四个问题就没有必要回答了。
双酶切验证是不保险的，最好是送测序，因为双酶切只能说明片段大小，不能知道是否有点突变。
蓝白斑筛选的原理见
http://baike.baidu.com/view/961540.htm
http://wenku.baidu.com/view/acb85ffbaef8941ea76e05c5.html
看完了就知道怎么做了。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-07-06 23:09:00
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friya0910

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-07-06 21:06:34
happywoheni(金币+1): 2011-07-07 07:17:02
引用回帖:
Originally posted by happywoheni at 2011-07-06 20:12:08:
求助啊，本人纯属菜鸟，问题较多，请大家帮帮忙！
1：引物中添加的限制性酶切位点是选择T载体上有的还是没有的？完全不懂！
2：我做基因克隆，用的上游引物5‘加了BamH1酶切位点，下游引物5’加了EcoR1酶切位点 ...

你用的载体是宝生物的pMD19-T载体吗？如果是的话，载体本身也带有BamHI的酶切位点的，还有你把目的基因连到T载体以后是要测序吗？还是要做什么后续实验啊？反正我之前用这个载体都是直接把目的片段和载体连接的，不用酶切，你可以看看宝生物的说明书的。
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2楼2011-07-06 20:32:25
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happywoheni

铁虫 (小有名气)
是用的宝生物的pMD19-T载体，连接完了要导入到大肠DH5a中。我的意思是我的引物和T载体有相同的两个限制性内切酶，会不会有影响？
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3楼2011-07-06 22:42:45
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-07 07:45:35
我建议你找个比较好的而且要超级耐心的买分子生物学试剂的公司电话打过去话聊，否则你这一个问题一个问题的还是比较多的。给你几个选择，ABI，Invitrogen，NEB，Takara，Stratagene，Progma等等，白天的时候打电话语聊吧。
顺便说一句，木虫上随便搜一下分子克隆第三版，做枕边书吧，晚上睡不着觉看看，挺好，能助眠的
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-07-06 23:37:36
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