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happywoheni铁虫 (小有名气)
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[求助]
【求助】基因克隆T载体酶切问题等
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求助啊，本人纯属菜鸟，问题较多，请大家帮帮忙！ 1：引物中添加的限制性酶切位点是选择T载体上有的还是没有的？完全不懂！ 2：我做基因克隆，用的上游引物5‘加了BamH1酶切位点，下游引物5’加了EcoR1酶切位点,可以用宝生物的pmD-19 T载体吗？ 3：我现在做pcr产物的纯化，想问一下，下一步T载体和pcr产物都要经过双酶切之后，再连接吗？还是T载体可以不用双酶切，只是pcr产物双酶切？还是其他？ 4：pcr产物可以直接双酶切吗，酶切缓冲液用哪一种，温度一个是30度一个是37度。 5：如果T载体不用酶切，直接连，酶切鉴定作用是什么？怎么做？用这两种限制性内切酶切吗？切完之后是不是有很多段？ 5：蓝白斑筛选操作步骤 在线等，急…… |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
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西瓜(金币+5, EPI+1): 果断EPI 2011-07-06 23:20:43
西瓜(金币+5, EPI+1): 果断EPI 2011-07-06 23:20:43
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引物中选择的酶切位点最好是在T载体上没有的，因为T载体连接上外源片段，验证正确之后，要双酶切质粒后跑电泳来回收外源片段。如果载体上有你设定的酶切位点，那么双酶切之后就不是只有载体和外源片段两条带了，但是如果你能保证不干扰你要回收的外源片段，双酶切之后你的外源片段还是能与其它条带分开，那么就没关系。 BamH1和EcoR1都是很常用的酶，一般载体上都有的，依照我上面说过的，只要能保证效果就可以。但是如果两个酶切位点相距太近，第一个酶切了之后第二个酶会结合不上去的。 T载体和PCR产物的连接不用双酶切，因为T-A连接是利用Taq酶在PCR产物3'末端有加上一个A的特性，使得Taq酶的PCR产物或经过Taq酶加A的PCR产物，和一个人工加上一个3'末端具有1个T的载体进行连接，由于突出末端可以互补，所以不用再进行其它酶切就能连接。 pcr产物最好别直接双酶切吗，经过回收之后再双酶切，体系里的其它物质会少一些，但是你的第三个问题解决了，这第四个问题就没有必要回答了。 双酶切验证是不保险的，最好是送测序，因为双酶切只能说明片段大小，不能知道是否有点突变。 蓝白斑筛选的原理见 http://baike.baidu.com/view/961540.htm http://wenku.baidu.com/view/acb85ffbaef8941ea76e05c5.html 看完了就知道怎么做了。 |
4楼2011-07-06 23:09:00
