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关于Western blot的抗体孵育阶段
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Western blot 丽春红染色已经确定转膜成功了，但是孵育后显色没有条带。 我介绍一下我的实验过程： 一抗：Anti-His-HRP 二抗：HRP-Rabbit-Anti-Mouse lgG 一抗，二抗都是用封闭液按1:5000稀释 使用的溶液如下（按照抗体说明书配制的）： PBS  137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4PBST PBS +0.05% Tween-20,v/v)Blocking buffer PBST + 5% nonfat, dry milk, w/v)孵育时，我把膜放到一个塑料样品袋中，然后加入抗体稀释剂，一抗过夜孵育，二抗孵育一小时，这样在样品袋中孵育是不是不利于抗体与膜上蛋白的结合，对孵育效果产生影响？怎样结合效果才好呢？ 显色步用的是 3%的4-氯-1-萘酚+30%双氧水+50mM的Tris-Hcl 室温下浸泡震荡大约30分钟（也是根据抗体说明书上面的方法）。 希望大家帮助啊！ [ Last edited by 烂铁 on 2011-5-25 at 14:22 ] |
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 【分子生物】EPI帖 |
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3楼2011-05-26 03:12:05
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, EPI+1): 很有经验，明显是专家！P.S. 三塔是指Santa Cruz吧？ 2011-05-26 12:33:21
烂铁(金币+10): 2011-05-26 14:10:40
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, EPI+1): 很有经验，明显是专家！P.S. 三塔是指Santa Cruz吧？ 2011-05-26 12:33:21
烂铁(金币+10): 2011-05-26 14:10:40
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1. 我不知道你的抗体是什么牌子的，如果是三塔之类的抗体1:5000显然是抗体的浓度太低，可以加大浓度，三塔的抗体一般我都用到1:1000/500，即使是AbCOM，cell signaling你的浓度也低，说明书只能说在最佳条件下才能有效（这种条件一般都不具备）。还有是不是能有个阳性结果作为对照（比如别人做出过来），当然抗体的批号要一致的。 2. 一抗封闭过夜最好在4度层析室或者层析柜里进行，如果在室温会严重影响抗体的效价。 3. 二抗封闭时间应该超过二小时，可以在室温进行。 4. 一抗， 二抗封闭之前应该用TBST(你的应该是PBST)洗3次，10min/次。 5. 显色我们用自配的 PCA Lum 1M Tris-Hcl(pH8.5) H2O2 H2O 个人感觉非常好用。 [ Last edited by 雪山飞狐7233 on 2011-5-26 at 06:00 ] |
4楼2011-05-26 05:57:14
