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烂铁

金虫 (小有名气)

[交流] 关于Western blot的抗体孵育阶段

Western blot
丽春红染色已经确定转膜成功了，但是孵育后显色没有条带。
我介绍一下我的实验过程：
一抗：Anti-His-HRP
二抗：HRP-Rabbit-Anti-Mouse lgG
一抗，二抗都是用封闭液按1:5000稀释
使用的溶液如下（按照抗体说明书配制的）：
PBS137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4
PBSTPBS +0.05% Tween-20,v/v)
Blocking buffer PBST + 5% nonfat, dry milk, w/v)

孵育时，我把膜放到一个塑料样品袋中，然后加入抗体稀释剂，一抗过夜孵育，二抗孵育一小时，这样在样品袋中孵育是不是不利于抗体与膜上蛋白的结合，对孵育效果产生影响？怎样结合效果才好呢？
显色步用的是  3%的4-氯-1-萘酚+30%双氧水+50mM的Tris-Hcl   室温下浸泡震荡大约30分钟（也是根据抗体说明书上面的方法）。

希望大家帮助啊！

[ Last edited by 烂铁 on 2011-5-25 at 14:22 ]
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1楼 2011-05-25 14:21:28
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wuzuobin125

铜虫 (小有名气)
★
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烂铁(金币+1): 2011-05-26 14:11:19
对这个不懂，只能帮你顶上去，让行家看到了。
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2楼2011-05-25 16:29:10
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forrestgump

新虫 (著名写手)
★ ★ ★
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西瓜(金币+2): 欢迎交流。浓度梯度如何设置呢？ 2011-05-26 12:33:47
烂铁(金币+2): 2011-05-26 14:11:04
一抗你得摸索一个浓度梯度，上来就1：5000是否很了点
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3楼2011-05-26 03:12:05
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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+5, EPI+1): 很有经验，明显是专家！P.S. 三塔是指Santa Cruz吧？ 2011-05-26 12:33:21
烂铁(金币+10): 2011-05-26 14:10:40
引用回帖:
Originally posted by 烂铁 at 2011-05-25 14:21:28:
Western blot
丽春红染色已经确定转膜成功了，但是孵育后显色没有条带。
我介绍一下我的实验过程：
一抗：Anti-His-HRP
二抗：HRP-Rabbit-Anti-Mouse lgG
一抗，二抗都是用封闭液按1:5000稀释
使用的溶液如 ...

1. 我不知道你的抗体是什么牌子的，如果是三塔之类的抗体1:5000显然是抗体的浓度太低，可以加大浓度，三塔的抗体一般我都用到1:1000/500，即使是AbCOM，cell signaling你的浓度也低，说明书只能说在最佳条件下才能有效（这种条件一般都不具备）。还有是不是能有个阳性结果作为对照（比如别人做出过来），当然抗体的批号要一致的。
2. 一抗封闭过夜最好在4度层析室或者层析柜里进行，如果在室温会严重影响抗体的效价。
3. 二抗封闭时间应该超过二小时，可以在室温进行。
4. 一抗， 二抗封闭之前应该用TBST(你的应该是PBST)洗3次，10min/次。
5. 显色我们用自配的
PCA
Lum
1M Tris-Hcl(pH8.5)
H2O2
H2O
个人感觉非常好用。

[ Last edited by 雪山飞狐7233 on 2011-5-26 at 06:00 ]
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4楼2011-05-26 05:57:14
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appleXYJ

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+3): 欢迎交流经验 2011-05-26 12:34:06
烂铁(金币+5): 2011-05-26 14:10:48
我们都是封闭过夜的，第二天做抗体反应实验！基本上都是一小时！
还有向楼上所说，抗体的浓度你参考说明书，至少要预实验看看那个浓度合适！
实验不是一次就做好的，要摸索几次的，一次做好就太简单了！祝你好运，加油！
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5楼2011-05-26 09:15:23
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烂铁

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 雪山飞狐7233 at 2011-05-26 05:57:14:
1. 我不知道你的抗体是什么牌子的，如果是三塔之类的抗体1:5000显然是抗体的浓度太低，可以加大浓度，三塔的抗体一般我都用到1:1000/500，即使是AbCOM，cell signaling你的浓度也低，说明书只能说在最佳条件 ...

三塔抗体是哪个公司的啊？我用的是invitrogen公司的抗体，我下次增加浓度试一试。一抗封闭时不需要震荡么？那要怎么在4度条件下进行啊，我们实验室没有层析室，只有4度冰箱。
还有抗体是用blocking buffer稀释还是用PBS稀释啊，我这两个说明书有冲突。
还有你们的显色液是什么配方啊，能不能具体一点，谢谢啊！

[ Last edited by 烂铁 on 2011-5-26 at 14:19 ]
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6楼2011-05-26 14:10:32
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
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烂铁(金币+2): 2011-05-29 11:26:06
引用回帖:
Originally posted by 烂铁 at 2011-05-26 14:10:32:
三塔抗体是哪个公司的啊？我用的是invitrogen公司的抗体，我下次增加浓度试一试。一抗封闭时不需要震荡么？那要怎么在4度条件下进行啊，我们实验室没有层析室，只有4度冰箱。
还有抗体是用blocking buffer ...

三塔应该是Santa Cruz吧。也是这方面的大公司啦。
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7楼2011-05-26 14:39:35
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西瓜and华华

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得你的一抗稀释浓度太大了，你应该做一个浓度梯度。第二：一抗封闭的时候你可以先在37度摇1-2h，然后放到4度冰箱过夜，这样是没有问题的哦。第三：显色液你可以选择Santa Cruz公司的ECL化学发光试剂，过程很简单，可以参考说明书，主要是没有DAB那么毒，DAB有潜在的致癌性。以上供你参考，希望你实验成功。
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8楼2012-04-10 16:07:40
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