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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
西瓜(金币+5, EPI+1): 很有经验,明显是专家!P.S. 三塔是指Santa Cruz吧? 2011-05-26 12:33:21
烂铁(金币+10): 2011-05-26 14:10:40
引用回帖:
Originally posted by 烂铁 at 2011-05-25 14:21:28:
Western blot
丽春红染色已经确定转膜成功了,但是孵育后显色没有条带。
我介绍一下我的实验过程:
一抗:Anti-His-HRP
二抗:HRP-Rabbit-Anti-Mouse lgG
一抗,二抗都是用封闭液按1:5000稀释
使用的溶液如 ...

1. 我不知道你的抗体是什么牌子的,如果是三塔之类的抗体1:5000显然是抗体的浓度太低,可以加大浓度,三塔的抗体一般我都用到1:1000/500,即使是AbCOM,cell signaling你的浓度也低,说明书只能说在最佳条件下才能有效(这种条件一般都不具备)。还有是不是能有个阳性结果作为对照(比如别人做出过来),当然抗体的批号要一致的。
2. 一抗封闭过夜最好在4度层析室或者层析柜里进行,如果在室温会严重影响抗体的效价。
3. 二抗封闭时间应该超过二小时,可以在室温进行。
4. 一抗, 二抗封闭之前应该用TBST(你的应该是PBST)洗3次,10min/次。
5. 显色我们用自配的
PCA
Lum
1M Tris-Hcl(pH8.5)
H2O2
H2O
个人感觉非常好用。

[ Last edited by 雪山飞狐7233 on 2011-5-26 at 06:00 ]
4楼2011-05-26 05:57:14
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