| 查看: 3538 | 回复: 7 | ||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
[交流]
关于Western blot的抗体孵育阶段
|
||||
|
Western blot 丽春红染色已经确定转膜成功了，但是孵育后显色没有条带。 我介绍一下我的实验过程： 一抗：Anti-His-HRP 二抗：HRP-Rabbit-Anti-Mouse lgG 一抗，二抗都是用封闭液按1:5000稀释 使用的溶液如下（按照抗体说明书配制的）： PBS  137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4PBST PBS +0.05% Tween-20,v/v)Blocking buffer PBST + 5% nonfat, dry milk, w/v)孵育时，我把膜放到一个塑料样品袋中，然后加入抗体稀释剂，一抗过夜孵育，二抗孵育一小时，这样在样品袋中孵育是不是不利于抗体与膜上蛋白的结合，对孵育效果产生影响？怎样结合效果才好呢？ 显色步用的是 3%的4-氯-1-萘酚+30%双氧水+50mM的Tris-Hcl 室温下浸泡震荡大约30分钟（也是根据抗体说明书上面的方法）。 希望大家帮助啊！ [ Last edited by 烂铁 on 2011-5-25 at 14:22 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有236人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- Western Blot实验的蛋白条带都连在一起
已经有37人回复
- WB抗体孵育问题！
已经有7人回复
- 关于western blot的一两个实验疑问。
已经有6人回复
- western抗体稀释、孵育的时间与条件的疑惑与不解
已经有10人回复
- 新手求助western blot
已经有22人回复
- 【求助/交流】westernblot
已经有10人回复
- 【求助/交流】western blot
已经有35人回复
- 【求助/交流】western-blot 一抗孵育时间是不是越长越好
已经有7人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
云南大学丁军桥团队2027年博士招生
+1/1986
-
面上中了，散金币。
+5/1930
-
散金币祈福
+5/368
-
货币银行学通俗教材版（一部超越哈耶克的经济学）
+1/252
-
【毕业前夕，畅谈科研】文集
+1/165
-
原子层沉积（ALD）磁控溅射PECVD等微纳代工服务：18817872921
+1/99
-
厦门大学崔明旭课题组招收2027届推免硕士/直博与申请考核博士生（金属有机、高分子）
+1/34
-
无穷无尽的科研生活焦虑
+4/20
-
招收CSC博士生（2027年9月入学）
+1/10
-
南京航空航天大学激光焊接与再制造技术研究所招收2027年博士研究生
+1/8
-
天津大学李轶：氢键有机框架：无贵金属原位产双氧水，实现自供电污水深度净化
+1/5
-
孩子开学啦
+1/5
-
厦大化院海优团队招收2027级【博士】和【推免硕士】研究生各2名
+1/4
-
2026年工程管理与智慧城市国际会议 (EMSC 2026)
+1/4
-
北航-国家级人才团队-招2027年9月博士
+1/2
-
中国科学院杭州医学研究所-科研助理，博士后及2027级博士招聘
+1/2
-
上海大学优青团队招聘硕士、博士研究生、博士后、实验员以及相关教职人员
+1/2
-
专利审查意见答复，是AI辅助生成中很难的一个功能...
+1/2
-
（香港大学）智能制造实验室招收27年春秋季入学全奖博士和硕士研究生
+1/1
-
寻求合作【大学教师】兼职出版顾问｜无需坐班｜一单5000元
+1/1
5楼2011-05-26 09:15:23
2楼2011-05-25 16:29:10
3楼2011-05-26 03:12:05
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, EPI+1): 很有经验，明显是专家！P.S. 三塔是指Santa Cruz吧？ 2011-05-26 12:33:21
烂铁(金币+10): 2011-05-26 14:10:40
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, EPI+1): 很有经验，明显是专家！P.S. 三塔是指Santa Cruz吧？ 2011-05-26 12:33:21
烂铁(金币+10): 2011-05-26 14:10:40
|
1. 我不知道你的抗体是什么牌子的，如果是三塔之类的抗体1:5000显然是抗体的浓度太低，可以加大浓度，三塔的抗体一般我都用到1:1000/500，即使是AbCOM，cell signaling你的浓度也低，说明书只能说在最佳条件下才能有效（这种条件一般都不具备）。还有是不是能有个阳性结果作为对照（比如别人做出过来），当然抗体的批号要一致的。 2. 一抗封闭过夜最好在4度层析室或者层析柜里进行，如果在室温会严重影响抗体的效价。 3. 二抗封闭时间应该超过二小时，可以在室温进行。 4. 一抗， 二抗封闭之前应该用TBST(你的应该是PBST)洗3次，10min/次。 5. 显色我们用自配的 PCA Lum 1M Tris-Hcl(pH8.5) H2O2 H2O 个人感觉非常好用。 [ Last edited by 雪山飞狐7233 on 2011-5-26 at 06:00 ] |
4楼2011-05-26 05:57:14
