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lihongyeer金虫 (正式写手)
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[求助]
DNA测序求助
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想通过16s rDNA来对微生物进行鉴定，但测序公司回复说：“您的样品（12株）的1492R向 的测序结果出现了重叠峰，测序失败，这有可能是您的模板存在污染，或是由于引物与模板的结合性不单一，导致扩增过程中有大小相近的非特异性条带杂片段产生，而琼脂糖回收无法分离这样的片段所致，建议您改进实验条件重新提供样品” 菌株我是通过四轮分离纯化的，应该不会全部污染，引物我用的是通用引物1492r和27f，DNA提取使用的天根生化的细菌基因组DNA提取试剂盒，请问各位有经验的虫友，现在该怎么做？ |
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lxj341401
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2楼2011-05-18 18:42:53
lihongyeer
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【答案】应助回帖
lihongyeer(金币+20): 多谢多谢！ 2011-05-23 15:38:38
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（1）换家公司，重新做PCR，回收后，送别家测序公司。公司测序，特别是PCR产物直接测序，经常会搞错的。不一定是他说的什么产物污染，出现大小相同的片段，跟测序手法也有关系的。出现大小相同的片段的概率很小的！或者在送这个公司，他可能会给你不同结果。 （2）连接T载体，现在T载体连接很好做的，好多公司出的简便的T载体，几个小时就连好，过夜后，筛斑，很快很简单。但是如果真的出现小相同的片段，那一定要挑取单菌落，这个很重要，而且最好多挑几个克隆，送测序。 （3）把自己的菌株在纯化，在活化，细菌DNA可以不用提取，直接加在PCR反应体系里就行，不用什么试剂盒，浪费。 （4）换其他16srDNA引物，这个文献里有，不难搞。 （先按第一条去弄，不行了，在弄下面的，很有可能就是公司没搞定，给你找借口呢，不用担心，不难搞） 祝你实验顺利！！ |
6楼2011-05-23 09:21:51
7楼2015-07-07 09:40:50