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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR总是无法正确扩增所需片段，问题在哪？
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dingjunrong

木虫 (小有名气)

[求助] PCR总是无法正确扩增所需片段，问题在哪？

我要扩增的是一个属的特异性片段1900bp,本来以为引物有问题，又合了一遍，还是扩不出，郁闷啊~
20ul体系：ddH2O 14.1ul    10×PCR Buffer 2ul    dNTP 2ul  引物各0.5ul   模板0.5ul
TaqE 0.4 ul
PCR反应程序：95度 5min 95度 1min   55度 1min  72度  3min  72度  10min
30个循环
求高人分析
电泳图如下：从左向右：marker10000,阳性样品，空白对照。marker条带由小至大：250bp,500bp,1000bp,2000bp,.......
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人生如戏~戏如人生
1楼 2011-05-11 10:40:51
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3, EPI+1): 2011-05-11 17:03:38
dingjunrong(金币+2): 2011-11-07 09:54:59
1：体系中DNTP加的有点多了，50ul体系中才添加1ul；
2：有没有设一个温度梯度，如果没有，可以设置一个温度梯度，根据你两条引物的的TM值，和除以5，然后上下加减几度试试，看看哪一个温度下P出来的最亮。
3：延伸时间3min有点长吧？你的目的片段1.9kb，最多2min就可以搞定。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-05-11 16:53:21
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fhh819

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): 鼓励 2011-05-11 12:41:36
dingjunrong(金币+2): 2011-11-07 09:54:42
我看了你的反应体系的成分后，觉得：
1、你的模板太少；实在不行模板量用4ul都可以。
2、dNTP的浓度如果是100mM的话，用量就只要0.4ul 。
3、相信退火温度的确定，不用说了吧。不过个人认为退火温度影响不是很大。
4、如果实在不行，就再次设计引物吧？尽量找保守区设计引物。
你试一试这个反应体系吧？
20ul体系：
ddH2O            14.4ul   
10×PCR Buffer      2ul   
dNTP                  0.4ul  
引物                 各0.4ul   
模板                    2ul
TaqE                 0.4 ul
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俱怀逸兴壮思飞，欲上青天揽明月！
2楼2011-05-11 11:05:04
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lly198784

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
1949stone(金币+4): 直接使用试剂盒 2011-05-11 12:41:59
dingjunrong(金币+3): 2011-05-12 09:35:24
我也是克隆一个3000多bp的基因，用的是根瘤菌基因组模板，PCR出来很多非特异性条带。我觉得不是体系的问题，不过我用的酶是pyrobest聚合酶，以前PCR都是用的这个酶，以前的模板是大肠杆菌基因组，这次的不知道怎么回事。要不你换个酶试试。
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3楼2011-05-11 11:21:45
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lly198784

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 1分钟也可以 2011-05-11 12:42:29
dingjunrong(金币+3): 谢谢 2011-05-12 09:35:37
你的延伸时间太长了，2min就够了，退火温度适当提高。
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4楼2011-05-11 11:24:18
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