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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR总是无法正确扩增所需片段，问题在哪？
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fhh819

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): 鼓励 2011-05-11 12:41:36
dingjunrong(金币+2): 2011-11-07 09:54:42
我看了你的反应体系的成分后，觉得：
1、你的模板太少；实在不行模板量用4ul都可以。
2、dNTP的浓度如果是100mM的话，用量就只要0.4ul 。
3、相信退火温度的确定，不用说了吧。不过个人认为退火温度影响不是很大。
4、如果实在不行，就再次设计引物吧？尽量找保守区设计引物。
你试一试这个反应体系吧？
20ul体系：
ddH2O            14.4ul   
10×PCR Buffer      2ul   
dNTP                  0.4ul  
引物                 各0.4ul   
模板                    2ul
TaqE                 0.4 ul
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俱怀逸兴壮思飞，欲上青天揽明月！
2楼2011-05-11 11:05:04
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【答案】应助回帖

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dhd997(金币+3, EPI+1): 2011-05-11 17:03:38
dingjunrong(金币+2): 2011-11-07 09:54:59
1：体系中DNTP加的有点多了，50ul体系中才添加1ul；
2：有没有设一个温度梯度，如果没有，可以设置一个温度梯度，根据你两条引物的的TM值，和除以5，然后上下加减几度试试，看看哪一个温度下P出来的最亮。
3：延伸时间3min有点长吧？你的目的片段1.9kb，最多2min就可以搞定。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-05-11 16:53:21
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