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dingjunrong

木虫 (小有名气)

[求助] 关于实时荧光定量PCR中绝对定量的一些问题

我要对样品中一个属的菌进行定量,模板是提取的基因组DNA,除了做标准曲线外还要有内标基因吗,如果要怎么选择,我是用自己连的质粒做标准曲线的,怎样才能准确测得它的浓度,从而确定它的拷贝数,标准曲线每次上样都要做一次吗?哪个公司的试剂盒质量比较好?万分感谢了~~
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love_st

金虫 (著名写手)


【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): Good 2011-05-11 13:40:08
dingjunrong(金币+5): 2011-05-12 09:32:43
待测样本浓度(ng/ul)=OD260×40×稀释倍数
样本分子量=碱基数×324
待测样本拷贝数(copies/ul)=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
2楼2011-05-11 10:58:38
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

dingjunrong(金币+5): 谢谢 2011-05-12 09:33:09
dingjunrong(金币+5): 2011-11-07 09:55:38
内参基因是需要的,可以消除样品量的差异,一般用actin,tublin,GAPDH等等。

标准曲线一般每次都要加入,因为PCR影响因素很多,同样的样品进行不同次的PCR得到的Ct值一般都不一样,只有同一次PCR里的样品和标准曲线才能进行有效比较。

试剂盒的话,我只用过Takara和天根的,没觉得有什么差异,但是Takara的是混好的一管,比较方便,天根的用之前还得把两个东西混起来(不知道现在新产品如何)。我们生科院总的来说,用Takara和Toyobo的比较多。提醒一下,有的试剂盒含Rox,有的不含,也有的公司单独卖。Rox是AB公司最先用来校正溶液量差异的一种荧光染料,AB公司的荧光定量PCR仪需要用到,其他公司的有的不能用,有的是用不用都可以,这个要留意下。个人推荐能用ROX就用。
3楼2011-05-11 13:39:56
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