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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 毕赤酵母转化后的鉴定
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worm2010

金虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母转化后的鉴定

我用的是pGAPZαA质粒转化毕赤后，抗生素筛选平板长出单菌落了，我下一步想摇瓶培养收集菌体裂解后PCR鉴定并测序。我用的是pGAPZαA质粒转化毕赤后，抗生素筛选平板长出单菌落了，我下一步想摇瓶培养收集菌体裂解后PCR鉴定并测序。
但是摇瓶时有个问题，就是加不加抗生素呢？师兄说要加，但是我发现加完抗生素摇瓶里的菌长得好慢啊！！！难道是没长吗？是不是加了抗生素的液体YPD菌体生长比较慢啊？我的菌是X33野生型的，请大家支招
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1楼 2011-05-04 09:52:33
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hh981236

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
worm2010(金币+3): 2011-05-07 19:29:03
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-05-07 21:16:03
毕赤酵母的外源基因会整合到染色体上，遗传比较稳定，培养时可以不加抗生素，最多每隔一段时间用抗生素平板筛选一下就可以了。PCR鉴定不用摇瓶发酵，直接把平板上的单克隆挑到PCR反应体系中即可，并把PCR的第一步预变性时间时间设置为3-4min。
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2楼2011-05-07 09:49:06
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worm2010

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by hh981236 at 2011-05-07 09:49:06:
毕赤酵母的外源基因会整合到染色体上，遗传比较稳定，培养时可以不加抗生素，最多每隔一段时间用抗生素平板筛选一下就可以了。PCR鉴定不用摇瓶发酵，直接把平板上的单克隆挑到PCR反应体系中即可，并把PCR的第一步 ...

感谢！
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3楼2011-05-07 19:29:23
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qiuqiushine

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hh981236 at 2011-05-07 09:49:06
毕赤酵母的外源基因会整合到染色体上，遗传比较稳定，培养时可以不加抗生素，最多每隔一段时间用抗生素平板筛选一下就可以了。PCR鉴定不用摇瓶发酵，直接把平板上的单克隆挑到PCR反应体系中即可，并把PCR的第一步预 ...

你好，我也是像你说的这样做的菌落PCR，可是我扩增不出目的条带，请问这是为什么呢？转化后的菌落在MD MM G418上都可以长
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4楼2013-12-16 16:25:25
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sunny00博博

新虫 (初入文坛)
您好，我是新手，最近也在做毕赤酵母的转化，质粒也是pGAPZαA，想问您菌落PCR的模板怎么制作的？
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5楼2014-07-13 20:00:30
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by qiuqiushine at 2013-12-16 16:25:25
你好，我也是像你说的这样做的菌落PCR，可是我扩增不出目的条带，请问这是为什么呢？转化后的菌落在MD MM G418上都可以长...

这是毕赤酵母转化中同源重组效率问题，同时毕赤酵母转化中产生假阳性的概率是比较大的。平板上长出菌落说明不了什么，选择培养基只是为了长出单菌落，用于之后的菌落PCR或其它方法鉴定。

菌落PCR不出条带就是没有转进去，没什么好疑问的。当然不排除PCR条件的问题，前面预变性需要10min，因为毕赤酵母属于真核生物。
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6楼2014-07-14 00:00:41
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小石头IX

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by qiuqiushine at 2013-12-16 16:25:25
你好，我也是像你说的这样做的菌落PCR，可是我扩增不出目的条带，请问这是为什么呢？转化后的菌落在MD MM G418上都可以长...

是不是需要破除细胞壁
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7楼2018-12-26 13:31:11
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