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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 原核同时表达两个蛋白，需要自行给其中一个加标签，请教了！！！
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1985ming1985

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核同时表达两个蛋白，需要自行给其中一个加标签，请教了！！！

我现在要用PQE30同时表达一个基因座上的两个基因，A和B，他们两个之间还有一段GAP，转录方向是从B向A，用PQE30表达之后，B蛋白的N末端有组氨酸标签 ，但是A什么都没有，所以就提取不出来（这部分已经做过了，的确可以同时表达），我就想在A的C末端加组氨酸标签，在反向引物中加了六个GTG（对应于正向的就是CAC，应该就是组氨酸的密码子），这样PCR之后就可以把组氨酸标签加在A的C末端，请问各位大侠这样成嘛？
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1楼 2011-04-29 23:20:48
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
加吧，加了之后上镍柱洗脱，运气好的话不用上其它层析柱都能分离
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2楼2011-04-29 23:55:52
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

1985ming1985(金币+2): 谢谢 2011-04-30 14:06:35
成，记得将A的终止密码子去掉或者突变掉。
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Thank-you，so-blue.
3楼2011-04-30 13:35:29
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1985ming1985

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-04-29 23:55:52:
加吧，加了之后上镍柱洗脱，运气好的话不用上其它层析柱都能分离

加了之后的引物我做了PCR，克隆测序争取，酶切于PQE30链接，转入M15做诱导表达，昨晚第一次诱导没有结果，很奇怪，没加标签之前做的那次表达显示两个蛋白都表达了，现在只是在末尾加了六个组氨酸标签就什么都没有表达，觉得很奇怪，测序正确，同样操作后就不会出现移码突变，加的是六个组氨酸标签那就是6个氨基酸，也不会引移码突变。奇怪了。
请问您做原核诱导的时候有没有遇见这种不存在移码突变但是还无法表达的？通过什么方法有可能使蛋白表达？
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4楼2011-04-30 14:11:14
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
不好意思我没遇到过，我只做过六个基因的表达而已，没做过几十个，经验不丰富。照理说应该会表达的，因为原先就能表达，克隆位点酶的切口都没问题的话，也不是稀有密码子的问题，怪了。
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5楼2011-04-30 16:09:09
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