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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急！！像这样的pcr结果怎么优化啊
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艾滋病癌症

银虫 (小有名气)

[求助] 急！！像这样的pcr结果怎么优化啊

本人因为毕业设计的缘故“被选择”了从未涉足的分子生物学方向，很多经验是恶补不来的。今天跑出了如下图的结果，师兄让优化一下但我小白一个，不太清楚从哪里入手。求指导

PS：marker是2000 的，750处是目的条带，它前面的三条比较纠结
我是50体系的，buffer5，dntp4,上下引物各2，模板1，酶0.5
合成单上的TM上71，下75
我用65度退火（60度也试过，效果不大）1分钟。30个循环

我想知道我目的条带前面的那三条分别是什么东西，怎么优化。如果告诉我用退火温度跑个梯度出来，是不行的哦


[ Last edited by 艾滋病癌症 on 2011-4-22 at 13:41 ]
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欲善其事，必先利其器
1楼2011-04-22 13:40:23
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 我也是啊 哈哈 哈哈 2011-04-22 17:52:20
要是我p成这样，会直接切胶回收的。有优化的时间，克隆都做好了。
PS：教坏小孩子了
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Thank-you，so-blue.
2楼2011-04-22 14:02:06
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艾滋病癌症

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-04-22 14:02:06:
要是我p成这样，会直接切胶回收的。有优化的时间，克隆都做好了。
PS：教坏小孩子了

嘿嘿嘿，已经如你所说啦
但是总得要搞一个漂亮的图吧
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欲善其事，必先利其器
3楼2011-04-22 14:17:47
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

这个有必要优化吗？这种图都不上的，直接切胶回收做克隆测序就行了
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在等待中涅槃重生
4楼2011-04-22 14:34:50
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★
艾滋病癌症(金币+5): 这就按部就班的做。你说的这些对纯新人来说就是如降甘露啊，谢啦 2011-04-22 15:02:42
西瓜(金币+2, EPI+1): 鼓励！天使继续加油啊~ 2011-04-22 15:29:11
1：你50ul体系不是很恰当，引物各加1ul，酶1ul,dNTP1ul,模板1ul，buffer5ul。
2：不知道你有没有做过温度梯度呢？就是看看哪一个问题下P出的条带是最亮的，然后选此温度大批量的进行扩增，如果没有，那么可以这样操作：首先两条引物的温度之和除以2，然后结果上下加减几度，就那你这两条引物来说吧，一个71，一个75，和除以2就是73，然后你可以做梯度：75 73 71 70 69 68 66等等。。。。看看哪一个温度下是最亮的。
3：750bp用一分钟就OK了，可以多循环一会，30个就行。。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-04-22 14:43:51
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艾滋病癌症

银虫 (小有名气)
1949stone: 这就很好了 2011-04-22 17:52:53
引用回帖:
Originally posted by yuxia82012 at 2011-04-22 14:34:50:
这个有必要优化吗？这种图都不上的，直接切胶回收做克隆测序就行了

啊？我确实是继续做下去了，但是师兄要求我优化出一张漂亮的图来。。。。
莫非老哥的意思是我的论文里根本用不到图？
PS：本科毕业设计，还没插手写呢
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欲善其事，必先利其器
6楼2011-04-22 14:44:50
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艾滋病癌症

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-22 14:43:51:
1：你50ul体系不是很恰当，引物各加1ul，酶1ul,dNTP1ul,模板1ul，buffer5ul。
2：不知道你有没有做过温度梯度呢？就是看看哪一个问题下P出的条带是最亮的，然后选此温度大批量的进行扩增，如果没有，那么可以这 ...

很好，非常具体，我准备试试。
本来想偷偷懒，看看那几条杂带的原因是什么，然后对症解决。但是貌似没有严谨的梯度验证的图是站不住脚的。我还是按部就班的做吧
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欲善其事，必先利其器
7楼2011-04-22 14:59:33
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

呵呵，不知道你这个克隆下来下一步做什么，论文里很少会放这种用于克隆的PCR的图片的
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在等待中涅槃重生
8楼2011-04-22 15:50:33
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xukewei

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+2): 是啊，呵呵~ 2011-04-22 17:30:27
西瓜(金币+2): 是啊，呵呵~ 2011-04-22 17:31:04
优化的话提高退火温度，减少退火和延伸时间，或做降落PCR
但你这种情况根本不需要，割胶后再跑个电泳图不就可以了啊
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Do what you love and love what you do!Do more than you are paid for!
9楼2011-04-22 15:55:32
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-04-22 17:31:04
引用回帖:
Originally posted by 艾滋病癌症 at 2011-04-22 14:17:47:
嘿嘿嘿，已经如你所说啦
但是总得要搞一个漂亮的图吧

切胶回收后，再跑电泳图片就漂亮了。
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Thank-you，so-blue.
10楼2011-04-22 16:17:36
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