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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR循环问题
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ureyguo

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR循环问题

我提取土壤DNA后， PCR建库， 我用20+40和30+30这两种循环次数，哪个结果靠谱些？说明原因！谢谢了！
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1楼 2011-04-11 09:49:13
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ureyguo

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-16 08:56:36
引用回帖:
Originally posted by ureyguo at 2011-05-10 22:39:15:
zhoujizhong AEM

(1) 从超低温冰箱中取出保存样品 (5 g)；
(2) 于室温融化；
(3) 加入13.5 mL CTAB 抽提缓冲液和50 μL 蛋白酶K 贮存液；
(4) 离心管于37oC 225 rpm 水平振荡30 min；
(5) 加入1.5 mL20%SDS；
(6) 65oC 水浴2 h，每隔15 min 轻轻颠倒数次；
(7) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，转移至一个新的50 mL 离心管中；
(8) 沉淀中再加入4.5 mL 提取液和0.5 mL 20%SDS，轻轻涡旋至混匀；
(9) 浸入液氮中冷冻3 min 后，于沸水中煮沸3 min；
(10) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，与上次上清液合并；
(11) 重复(8)、(9)、(10)一次；
(12) 将三次提取所获上清液与等体积的苯酚：氯仿(1:1 v/v) 混合，摇匀后于4 oC
12,000g 离心10 min；
(13) 将上层水相转移至一新的50 mL 离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，
混匀后于4 oC 12,000g 离心10 min；
(14) 再次转移上清至一新的离心管中，加入0.6 倍体积的异丙醇于室温沉淀1 h；
(15) 室温12,000g 离心20 min；
(16) 收集沉淀，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀；
(17) 向离心管中加入1 mL TE，于4 oC 放置过夜，分装保存于‐20 oC。
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8楼2011-05-15 11:01:01
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 过来人啊 2011-04-11 12:39:06
这个其实真的不太了解，不过如果你后期还要进行实验而非验证的话最好多循环一会。。。。
有待高人解答！
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2楼2011-04-11 11:40:04
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by ureyguo at 2011-04-11 09:49:13:
我提取土壤DNA后， PCR建库， 我用20+40和30+30这两种循环次数，哪个结果靠谱些？说明原因！谢谢了！

坐等高人
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3楼2011-04-11 12:41:48
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ureyguo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-11 11:40:04:
这个其实真的不太了解，不过如果你后期还要进行实验而非验证的话最好多循环一会。。。。
有待高人解答！

不是验证，是拿这个产物建库。有没有高手，这样建过库，最好是大库。谢谢！
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4楼2011-04-11 13:10:27
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ureyguo12楼
2011-05-16 21:33   回复  
引用回帖:
Originally posted by passingby at 2011-05-16 12:43:25: 土壤里的微生物吗？

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