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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR循环问题
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ureyguo

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR循环问题

我提取土壤DNA后， PCR建库， 我用20+40和30+30这两种循环次数，哪个结果靠谱些？说明原因！谢谢了！
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1楼 2011-04-11 09:49:13
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 过来人啊 2011-04-11 12:39:06
这个其实真的不太了解，不过如果你后期还要进行实验而非验证的话最好多循环一会。。。。
有待高人解答！
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2楼2011-04-11 11:40:04
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by ureyguo at 2011-04-11 09:49:13:
我提取土壤DNA后， PCR建库， 我用20+40和30+30这两种循环次数，哪个结果靠谱些？说明原因！谢谢了！

坐等高人
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3楼2011-04-11 12:41:48
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ureyguo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-11 11:40:04:
这个其实真的不太了解，不过如果你后期还要进行实验而非验证的话最好多循环一会。。。。
有待高人解答！

不是验证，是拿这个产物建库。有没有高手，这样建过库，最好是大库。谢谢！
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4楼2011-04-11 13:10:27
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
ureyguo(金币+1): 2011-04-11 16:43:48
引用回帖:
Originally posted by ureyguo at 2011-04-11 09:49:13:
我提取土壤DNA后， PCR建库， 我用20+40和30+30这两种循环次数，哪个结果靠谱些？说明原因！谢谢了！

你还记得小马过河的故事吗？你做的东西应该没几个人做过，更何况你问的是这么具体的问题，自己去试试吧！
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5楼2011-04-11 14:18:25
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yabing0324

金虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
请问你提DNA的方法是？我最近在做，效果不好
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6楼2011-05-09 22:03:48
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ureyguo

木虫 (正式写手)
★ ★
西瓜(金币+2): 啊哈？可否说得详细些？Anyway，鼓励交流。 2011-05-11 00:21:23
引用回帖:
Originally posted by yabing0324 at 2011-05-09 22:03:48:
请问你提DNA的方法是？我最近在做，效果不好

zhoujizhong AEM
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7楼2011-05-10 22:39:15
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ureyguo

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-16 08:56:36
引用回帖:
Originally posted by ureyguo at 2011-05-10 22:39:15:
zhoujizhong AEM

(1) 从超低温冰箱中取出保存样品 (5 g)；
(2) 于室温融化；
(3) 加入13.5 mL CTAB 抽提缓冲液和50 μL 蛋白酶K 贮存液；
(4) 离心管于37oC 225 rpm 水平振荡30 min；
(5) 加入1.5 mL20%SDS；
(6) 65oC 水浴2 h，每隔15 min 轻轻颠倒数次；
(7) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，转移至一个新的50 mL 离心管中；
(8) 沉淀中再加入4.5 mL 提取液和0.5 mL 20%SDS，轻轻涡旋至混匀；
(9) 浸入液氮中冷冻3 min 后，于沸水中煮沸3 min；
(10) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，与上次上清液合并；
(11) 重复(8)、(9)、(10)一次；
(12) 将三次提取所获上清液与等体积的苯酚：氯仿(1:1 v/v) 混合，摇匀后于4 oC
12,000g 离心10 min；
(13) 将上层水相转移至一新的50 mL 离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，
混匀后于4 oC 12,000g 离心10 min；
(14) 再次转移上清至一新的离心管中，加入0.6 倍体积的异丙醇于室温沉淀1 h；
(15) 室温12,000g 离心20 min；
(16) 收集沉淀，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀；
(17) 向离心管中加入1 mL TE，于4 oC 放置过夜，分装保存于‐20 oC。
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8楼2011-05-15 11:01:01
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zhangyonghu

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by ureyguo at 2011-05-15 11:01:01:
(1) 从超低温冰箱中取出保存样品 (5 g)；
(2) 于室温融化；
(3) 加入13.5 mL CTAB 抽提缓冲液和50 μL 蛋白酶K 贮存液；
(4) 离心管于37oC 225 rpm 水平振荡30 min；
(5) 加入1.5 mL20%SDS；
(6) 65oC 水 ...

为什么不用试剂盒啊
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9楼2011-05-15 11:50:32
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ureyguo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhangyonghu at 2011-05-15 11:50:32:
为什么不用试剂盒啊

试剂盒不一定好用
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10楼2011-05-15 20:42:33
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passingby

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
土壤里的微生物吗？
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11楼2011-05-16 12:43:25
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zhangyonghu

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
ureyguo(金币+1): 2011-05-16 22:15:20
引用回帖:
Originally posted by ureyguo at 2011-05-15 20:42:33:
试剂盒不一定好用

对，得找到合适的，有的需要加一些步骤
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13楼2011-05-16 21:49:19
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ureyguo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhangyonghu at 2011-05-16 21:49:19:
对，得找到合适的，有的需要加一些步骤

关键是有的试剂盒也蛮繁琐的
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14楼2011-05-16 22:15:45
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ureyguo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by ureyguo at 2011-04-11 09:49:13:
我提取土壤DNA后， PCR建库， 我用20+40和30+30这两种循环次数，哪个结果靠谱些？说明原因！谢谢了！

我的结果是循环多的变异少。
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15楼2011-06-03 10:07:59
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yj507

金虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我想请问一下你这样提出来的DNA能看到主带吗？
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16楼2011-06-04 13:38:22
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ureyguo12楼
2011-05-16 21:33   回复  
引用回帖:
Originally posted by passingby at 2011-05-16 12:43:25: 土壤里的微生物吗？

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