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syd89522

木虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】RT-PCR最原始的做法然后描述

就是最老套的半定量PCR，被问之what tpye of RT-PCR and what conditions were used for extraction and expression of RNA probes?该如何回答呢？请教高手

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1楼 2011-03-19 16:33:05

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xjc521

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 640830

★ ★ ★ ★
syd89522(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+3): 辛苦~ 2011-03-27 20:32:55

RT-PCR 步骤
1）向需要裂解的细胞中加入1ml的Tirozl
2）加入20%的三氯甲烷剧烈震荡15秒，冰上静置2~3min，4度离心12000rpm/min 15min
4）吸取上层液体放入到新的DEPC处理过的EP管中，加入等量的异丙醇轻柔摇晃15秒，冰上静置10分钟，4度离心12000rpm/min 10min
5）弃去上清加入1ml 75%酒精（配的水用DEPC处理），4度离心12000rpm/min 5min，弃去上清
6）重复步骤5
7）弃去上清，加入50微升的DEPC水溶解后备用

RT-PCR 20微升体系
RNA  10微升
AMV  2微升
dNTP 2微升
oLigd(T) 1微升
HRP 1微升
5 X buffer  4微升

RT-PCR步骤
将10微升RNA溶液 65度预变性10分钟
冰上冷却10分钟
加入其它成分
30度 10分钟
42度 1小时
72度 15分钟
4度  结束