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syd89522

木虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】RT-PCR最原始的做法然后描述

就是最老套的半定量PCR,被问之what tpye of RT-PCR and what conditions were used for extraction and expression of RNA probes?该如何回答呢?请教高手
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★ ★
syd89522(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-03-27 18:34:05
RT现在可以理解为实时定量或者逆转录,人家的意思是叫你表述清楚
以及PCR的条件如何,引物长神马样子
2楼2011-03-19 16:48:42
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jmsh784038

木虫 (正式写手)



syd89522(金币+1):谢谢参与
RT现在可以理解为实时定量或者逆转录
3楼2011-03-27 18:21:50
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xjc521

新虫 (初入文坛)


★ ★ ★ ★
syd89522(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+3): 辛苦~ 2011-03-27 20:32:55
RT-PCR 步骤
1)向需要裂解的细胞中加入1ml的Tirozl
2)加入20%的三氯甲烷剧烈震荡15秒,冰上静置2~3min,4度离心12000rpm/min 15min
4)吸取上层液体放入到新的DEPC处理过的EP管中,加入等量的异丙醇轻柔摇晃15秒,冰上静置10分钟,4度离心12000rpm/min 10min
5)弃去上清加入1ml 75%酒精(配的水用DEPC处理),4度离心12000rpm/min 5min,弃去上清
6)重复步骤5
7)弃去上清,加入50微升的DEPC水溶解后备用

RT-PCR 20微升体系
RNA  10微升
AMV  2微升
dNTP 2微升
oLigd(T) 1微升
HRP 1微升
5 X buffer  4微升  


RT-PCR步骤
将10微升RNA溶液 65度预变性10分钟
冰上冷却10分钟
加入其它成分
30度 10分钟
42度 1小时
72度 15分钟
4度  结束
4楼2011-03-27 19:58:48
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