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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】Thrombin protease切GST问题
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yzfjfx1986

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】Thrombin protease切GST问题

我目的蛋白-GST为36分子量，目的蛋白10kDa左右，GST26kDa，用10u 20u 40u 去切GST，我前面用10u切了15小时，切不出目的蛋白，用GSH去还原胶，跑SDS-PAGE,果然还在胶上，应该说明没切下来，因此我用20u 40u去切20个小时（前面短时间2h，3h也切过，效果一样不好），这次有些短的条带出来了，但仍找不见目的条带，因此想问下用几U和多少时间去切是最佳的，希望哪位高手可答复下，急啊
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1楼2011-03-04 20:19:11
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
yzfjfx1986(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+1): 感谢交流 2011-03-06 15:01:06
试过换温度么？我们有的时候4度切不掉就20度或者37度切。不知道你用的酶和我们用的一样不。 我们的用量一般是按体积来算的， 1-2U/ml。
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2楼2011-03-04 21:11:24
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yzfjfx1986

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-04 21:11:24:
试过换温度么？我们有的时候4度切不掉就20度或者37度切。不知道你用的酶和我们用的一样不。 我们的用量一般是按体积来算的， 1-2U/ml。

我凝血酶来自牛血清，要求20-22度，也在这个温度下切了，4度没试过，根据说明书应该是不可以的，酶活会很低，反正切了收集的上清中没找到要的目的条带，我继续用GSH去还原剩下的含GST或GST-杂蛋白的胶（中间用PBS洗下），结果提下来的居然在10左右出现了一个条带，让我感到非常奇怪，我要的那个条带居然在Thrombin后留在了胶了，而且这个蛋白不可能是与GST结合的（远远低于26kDa），它怎么会留在胶上？？
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3楼2011-03-06 12:08:39
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by yzfjfx1986 at 2011-03-06 12:08:39:
我凝血酶来自牛血清，要求20-22度，也在这个温度下切了，4度没试过，根据说明书应该是不可以的，酶活会很低，反正切了收集的上清中没找到要的目的条带，我继续用GSH去还原剩下的含GST或GST-杂蛋白的胶（中间用P ...

好诡异啊。。。
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4楼2011-03-06 12:14:21
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郜珊

新虫 (初入文坛)
★
yzfjfx1986(金币+1): 谢谢参与
你好好查一下，你的目的蛋白的序列中是否有凝血酶酶切位点，如果有的话，可能凝血酶把目的条带切下来一部分。
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5楼2013-01-23 12:52:19
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