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汕头大学海洋科学接受调剂
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yzfjfx1986

金虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】Thrombin protease切GST问题

我目的蛋白-GST为36分子量,目的蛋白10kDa左右,GST26kDa,用10u 20u 40u 去切GST,我前面用10u切了15小时,切不出目的蛋白,用GSH去还原胶,跑SDS-PAGE,果然还在胶上,应该说明没切下来,因此我用20u 40u去切20个小时(前面短时间2h,3h也切过,效果一样不好),这次有些短的条带出来了,但仍找不见目的条带,因此想问下用几U和多少时间去切是最佳的,希望哪位高手可答复下,急啊
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yzfjfx1986

金虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-04 21:11:24:
试过换温度么?我们有的时候4度切不掉就20度或者37度切。不知道你用的酶和我们用的一样不。 我们的用量一般是按体积来算的, 1-2U/ml。

我凝血酶来自牛血清,要求20-22度,也在这个温度下切了,4度没试过,根据说明书应该是不可以的,酶活会很低,反正切了收集的上清中没找到要的目的条带,我继续用GSH去还原剩下的含GST或GST-杂蛋白的胶(中间用PBS洗下),结果提下来的居然在10左右出现了一个条带,让我感到非常奇怪,我要的那个条带居然在Thrombin后留在了胶了,而且这个蛋白不可能是与GST结合的(远远低于26kDa),它怎么会留在胶上??
3楼2011-03-06 12:08:39
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★ ★
yzfjfx1986(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+1): 感谢交流 2011-03-06 15:01:06
试过换温度么?我们有的时候4度切不掉就20度或者37度切。不知道你用的酶和我们用的一样不。 我们的用量一般是按体积来算的, 1-2U/ml。
2楼2011-03-04 21:11:24
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引用回帖:
Originally posted by yzfjfx1986 at 2011-03-06 12:08:39:
我凝血酶来自牛血清,要求20-22度,也在这个温度下切了,4度没试过,根据说明书应该是不可以的,酶活会很低,反正切了收集的上清中没找到要的目的条带,我继续用GSH去还原剩下的含GST或GST-杂蛋白的胶(中间用P ...

好诡异啊。。。
4楼2011-03-06 12:14:21
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郜珊

新虫 (初入文坛)



yzfjfx1986(金币+1): 谢谢参与
你好好查一下,你的目的蛋白的序列中是否有凝血酶酶切位点,如果有的话,可能凝血酶把目的条带切下来一部分。
5楼2013-01-23 12:52:19
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