[交流] 【求助/交流】Thrombin protease切GST问题

我目的蛋白-GST为36分子量，目的蛋白10kDa左右，GST26kDa，用10u 20u 40u 去切GST，我前面用10u切了15小时，切不出目的蛋白，用GSH去还原胶，跑SDS-PAGE,果然还在胶上，应该说明没切下来，因此我用20u 40u去切20个小时（前面短时间2h，3h也切过，效果一样不好），这次有些短的条带出来了，但仍找不见目的条带，因此想问下用几U和多少时间去切是最佳的，希望哪位高手可答复下，急啊

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1楼2011-03-04 20:19:11

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yzfjfx1986

金虫 (正式写手)

应助: 1 (幼儿园)
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引用回帖:

Originally posted by brightfuture01 at 2011-03-04 21:11:24:
试过换温度么？我们有的时候4度切不掉就20度或者37度切。不知道你用的酶和我们用的一样不。我们的用量一般是按体积来算的， 1-2U/ml。

我凝血酶来自牛血清，要求20-22度，也在这个温度下切了，4度没试过，根据说明书应该是不可以的，酶活会很低，反正切了收集的上清中没找到要的目的条带，我继续用GSH去还原剩下的含GST或GST-杂蛋白的胶（中间用PBS洗下），结果提下来的居然在10左右出现了一个条带，让我感到非常奇怪，我要的那个条带居然在Thrombin后留在了胶了，而且这个蛋白不可能是与GST结合的（远远低于26kDa），它怎么会留在胶上？？

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3楼2011-03-06 12:08:39

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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

★ ★
yzfjfx1986(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+1): 感谢交流 2011-03-06 15:01:06

试过换温度么？我们有的时候4度切不掉就20度或者37度切。不知道你用的酶和我们用的一样不。我们的用量一般是按体积来算的， 1-2U/ml。

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2楼2011-03-04 21:11:24

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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

引用回帖:

Originally posted by yzfjfx1986 at 2011-03-06 12:08:39:
我凝血酶来自牛血清，要求20-22度，也在这个温度下切了，4度没试过，根据说明书应该是不可以的，酶活会很低，反正切了收集的上清中没找到要的目的条带，我继续用GSH去还原剩下的含GST或GST-杂蛋白的胶（中间用P ...

好诡异啊。。。