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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】DNA提取方法（用于PCR-DGGE）
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vanewan

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】DNA提取方法（用于PCR-DGGE）

我是环境专业的，课题做到这里导师要我用PCR-DGGE生物技术来做菌群分析。
    我的反应器是陶粒反应器，具体的就是在陶粒上负载吸附了能处理特定污染物的菌体,导师让我每个实验阶段都取样去做优势菌群分析。
    请问各位大虾我这个情况，要提取菌的DNA要用怎样的方法？还有陶粒上的微生物怎样才能全部洗脱下来做菌群分析？
    在生物方面我只知道皮毛，劳请各位生物方面做过这方面研究的同仁们了！
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1楼2011-02-24 17:20:57
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glidingwater

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
翱宇(金币+1): 鼓励新虫 2011-02-24 19:46:13
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-02-24 19:48:07
vanewan(金币+10): 2011-02-26 18:11:40
使用试剂盒提取总DNA,然后进行PCR，就是做个16s rRNA基因高可变片段的扩增，每种菌虽具有相同长度但具有碱基不同组合的片段，然后进行DGGE，得到条带的多样性，就是菌群的多样性了。
条带粗细的变化反应着优势菌群的变化

[ Last edited by glidingwater on 2011-2-24 at 19:09 ]
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2楼2011-02-24 18:46:41
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vanewan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by glidingwater at 2011-02-24 18:46:41:
使用试剂盒提取总DNA,然后进行PCR，就是做个16s rRNA基因高可变片段的扩增，每种菌虽具有相同长度但具有碱基不同组合的片段，然后进行DGGE，得到条带的多样性，就是菌群的多样性了。
条带粗细的变化反应着优势菌 ...

谢谢你的回答，再问下做RNA和DNA扩增有什么区别，哪个更好或者更简便？
有必要做GC夹板吗？
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3楼2011-02-25 10:05:45
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glidingwater

银虫 (小有名气)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-02-26 08:56:35
vanewan(金币+3): 2011-02-26 18:11:30
RNA目前似乎是难以扩增的
若要增加其量，还需反转录为DNA进行扩增的
引物有必要加上GC-clamp。
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4楼2011-02-25 22:14:42
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在雨中

金虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
silicare(金币+4): 很专家~ 2011-02-26 11:49:02
vanewan(金币+5): 2011-02-26 18:09:15
如果做DGGE的话，什么样的提取方法不重要吧？只要提取的质量好。
如果做细菌的，可以使用V3区的引物 GC338F和518R这对，做DGGE最好看。
如果做真菌的话，可以使用GCFung 和NS1。
GC是GC夹子的意思。做DGGE肯定要用GC夹，防止聚丙烯酰胺胶电泳的时候的DNA彻底解链。
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5楼2011-02-26 10:32:49
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vanewan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 在雨中 at 2011-02-26 10:32:49:
如果做DGGE的话，什么样的提取方法不重要吧？只要提取的质量好。
如果做细菌的，可以使用V3区的引物 GC338F和518R这对，做DGGE最好看。
如果做真菌的话，可以使用GCFung 和NS1。
GC是GC夹子的意思。做DGGE肯定 ...

谢谢你的回答，做DGGE有两种凝胶，一种是变性琼脂糖凝胶，一种是变性聚丙烯酰胺凝胶，我做的是细菌总DNA的鉴定，请问用哪种凝胶好点？我也不知道它的DNA长度有多长
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6楼2011-02-26 18:11:10
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在雨中

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
rainwander(金币+3): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-02-27 16:40:59
vanewan(金币+2): 2011-02-27 16:52:06
引用回帖:
Originally posted by vanewan at 2011-02-26 18:11:10:
谢谢你的回答，做DGGE有两种凝胶，一种是变性琼脂糖凝胶，一种是变性聚丙烯酰胺凝胶，我做的是细菌总DNA的鉴定，请问用哪种凝胶好点？我也不知道它的DNA长度有多长

DGGE就是聚丙烯酰胺凝胶电泳的简称嘛。我没有听说过还有“变性琼脂糖凝胶”这个种DGGE胶。。
DGGE方法有其限制，所使用的PCR产物，带GC夹，长度只有小于500bp的PCR产物才能得到最后的分离。所以这么短的PCR产物所包含的序列信息是有限的。很多不同条带测序后的结果竟然是同一物种。。
如果你做细菌的话，可以用下比较长的引物做DGGE，比如引物341F和907R，这个扩增产物较长，但有时DGGE不怎么好看，因为PCR产物分离的不彻底，太长了。
如果想得到很好看的细菌图谱，就用338F和518R吧，这个只有180bp的PCR片段在DGGE的时候会得到最彻底的分离。
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7楼2011-02-27 13:43:45
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rainwander

铁杆木虫 (知名作家)
楼上已经说的很详细了
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8楼2011-02-27 16:42:05
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vanewan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 在雨中 at 2011-02-27 13:43:45:
DGGE就是聚丙烯酰胺凝胶电泳的简称嘛。我没有听说过还有“变性琼脂糖凝胶”这个种DGGE胶。。
DGGE方法有其限制，所使用的PCR产物，带GC夹，长度只有小于500bp的PCR产物才能得到最后的分离。所以这么短的PCR产 ...

谢谢，接着请问，我用超声波破碎法使陶粒上的微生物洗脱下来，对后续做电泳有没有影响？对DNA片段有没有影响？
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9楼2011-02-27 17:01:51
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在雨中

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2): 再次鼓励 2011-02-27 21:19:24
引用回帖:
Originally posted by vanewan at 2011-02-27 17:01:51:
谢谢，接着请问，我用超声波破碎法使陶粒上的微生物洗脱下来，对后续做电泳有没有影响？对DNA片段有没有影响？

我常用蛋白酶K-CTAB法提取环境样品中的DNA，超声波破碎法实验室的前辈有人尝试过，据说效果也就那样，可能跟样品特性有关。
我觉得如果你超声时间和强度把握好的话，对DNA片度是没有多大影响的。
你可以用超声波法将载体上的细胞洗脱下来，然后离心（大概5000-6000g，10min），然后采取相应方法提取DNA。我年前帮人这么做过，效果非常不错。
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10楼2011-02-27 21:15:44
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vanewan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 在雨中 at 2011-02-27 21:15:44:
我常用蛋白酶K-CTAB法提取环境样品中的DNA，超声波破碎法实验室的前辈有人尝试过，据说效果也就那样，可能跟样品特性有关。
我觉得如果你超声时间和强度把握好的话，对DNA片度是没有多大影响的。
你可以用超声 ...

谢谢！感激不尽！
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11楼2011-02-28 14:32:31
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vanewan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 在雨中 at 2011-02-27 21:15:44:
我常用蛋白酶K-CTAB法提取环境样品中的DNA，超声波破碎法实验室的前辈有人尝试过，据说效果也就那样，可能跟样品特性有关。
我觉得如果你超声时间和强度把握好的话，对DNA片度是没有多大影响的。
你可以用超声 ...

你好，再请问DGGE的变性梯度凝胶怎么做啊？在一般的制胶器上面能做吗？
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12楼2011-03-01 11:07:59
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在雨中

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by vanewan at 2011-03-01 11:07:59:
你好，再请问DGGE的变性梯度凝胶怎么做啊？在一般的制胶器上面能做吗？

我们实验室是Bio-Rad公司的DGGE系统。胶是那个滚轴进样器做的呀
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13楼2011-03-01 11:25:51
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vanewan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 在雨中 at 2011-03-01 11:25:51:
我们实验室是Bio-Rad公司的DGGE系统。胶是那个滚轴进样器做的呀

哦，了解了，那一般的制胶器是做不了了
如果我要做细菌菌群分析一定要用DGGE吗？可以做蛋白质分析吗？出同样效果的话
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14楼2011-03-01 11:30:05
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在雨中

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by vanewan at 2011-03-01 11:30:05:
哦，了解了，那一般的制胶器是做不了了
如果我要做细菌菌群分析一定要用DGGE吗？可以做蛋白质分析吗？出同样效果的话

没有做过蛋白质，貌似有点难度。
细菌群落分析的话那你使用的方法必须是专门针对细菌的呀？
很多分子方法可能做的话把真菌，放线菌等也做出来了。。。
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15楼2011-03-01 12:28:19
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vanewan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 在雨中 at 2011-03-01 12:28:19:
没有做过蛋白质，貌似有点难度。
细菌群落分析的话那你使用的方法必须是专门针对细菌的呀？
很多分子方法可能做的话把真菌，放线菌等也做出来了。。。

好的，非常感谢~~
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16楼2011-03-01 15:36:54
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yourss520

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
问一下，这个GC338F的序列是什么？
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17楼2012-12-10 08:51:43
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海之子211

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
GC是夹子           2007年的文献“A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria”文献中V1-V9的分区如下：
    The nine hypervariable regions spanned nucleotides 69-99, 137-242, 433-497, 576-682, 822-879, 986-1043, 1117-1173, 1243-1294     F是上游引物
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18楼2013-01-08 14:15:16
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zuihouyizhan

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by 在雨中 at 2011-02-27 21:15:44
我常用蛋白酶K-CTAB法提取环境样品中的DNA，超声波破碎法实验室的前辈有人尝试过，据说效果也就那样，可能跟样品特性有关。
我觉得如果你超声时间和强度把握好的话，对DNA片度是没有多大影响的。
你可以用超声波 ...

你好，请问你那有蛋白酶K-CTAB法的具体操作方法吗，有的话能不能发我一份，万分感谢
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19楼2013-06-08 16:41:34
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在雨中

金虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by vanewan at 2011-03-01 15:36:54
好的，非常感谢~~...

两年多前回复的帖子，到现在才有回应，撸主你去干嘛了？？？？
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20楼2013-06-09 09:21:52
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laishu

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by 在雨中 at 2011-02-27 21:15:44
我常用蛋白酶K-CTAB法提取环境样品中的DNA，超声波破碎法实验室的前辈有人尝试过，据说效果也就那样，可能跟样品特性有关。
我觉得如果你超声时间和强度把握好的话，对DNA片度是没有多大影响的。
你可以用超声波 ...

你好，我也是用类似的方法做的，当是做出来的dna质量不怎么样好，有时候pcr还扩增不出来呀
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21楼2013-09-21 12:43:36
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