应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】如何降低，多克隆抗体非特异性？
131/2返回列表12下一页
查看: 3341  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

未知树

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】如何降低，多克隆抗体非特异性？ 已有7人参与

制备了一种多抗，但是，在进行细胞内免疫荧光实验时，非特异性非常非常的强，几乎与实验组无法区分。

制备过程：
1，克隆目的基因至表达载体pMal-C4x。
2，表达纯化目的蛋白。X-MBP（带有MBP标签的融合蛋白）
3，纯化融合蛋白X-MBP，很纯！
4，注射新西兰大白兔。
5，收集血清。


PS： 注射大白兔之前，没有切除标签蛋白MBP（约42KDa）.
在western blot试验中， 该抗体的特异性非常好。 但是， 当用于细胞实验室时， 非特异性出奇的高， 实验组和对照组， 一模一样， 几乎看不出任何区别。

在网上查看看了一些方法， 仍然不是太明白。

如何才能有效地降低特异性。  
请各位虫友支招，万分感谢~
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

金、磁珠与抗体的结合

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
每一天都是一个新的起点
1楼 2011-02-14 22:40:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dianaofyezi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+5): good 2011-02-15 09:29:29
可能原因：
1.多抗是否纯化？去除非特异性的其他蛋白？WB和荧光对抗体的要求是不同的。
2.细胞中是否有其他蛋白与其有交叉反应？
3.阴性对照结果如何，即用同源的抗体进行试验？
赞一下(2人) 回复此楼
52187644
2楼2011-02-15 09:03:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+5): good 2011-02-15 14:11:36
1、用你纯化的重组蛋白偶联制作亲和层析介质，然后进行亲和纯化。
2、设计多肽免疫。
3、非融合表达目的蛋白。

但不管怎样免疫，用免疫原偶联进行亲和纯化都是需要的。用抗血清效果肯定要差些。
赞一下(2人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

hyanzi9920
VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
3楼2011-02-15 09:30:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-02-15 14:11:52
免疫荧光对抗体要求很高，都是用单克隆抗体做的吧
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2011-02-15 14:05:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

未知树

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by snoopyzxx at 2011-02-15 09:30:23:
1、用你纯化的重组蛋白偶联制作亲和层析介质，然后进行亲和纯化。
2、设计多肽免疫。
3、非融合表达目的蛋白。

但不管怎样免疫，用免疫原偶联进行亲和纯化都是需要的。用抗血清效果肯定要差些。

没有啊， 我们实验室的另外一种抗体，就是多抗啊， 是用纯化的病毒粒子，直接注射大白兔得到的。 用的也非常的好啊
赞一下 回复此楼
每一天都是一个新的起点
5楼2011-02-15 17:14:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

未知树

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2011-02-15 09:03:12:
可能原因：
1.多抗是否纯化？去除非特异性的其他蛋白？WB和荧光对抗体的要求是不同的。
2.细胞中是否有其他蛋白与其有交叉反应？
3.阴性对照结果如何，即用同源的抗体进行试验？

1，抗体没有纯化，直接取的兔血清。
2，细胞中如果有其他蛋白与其有交叉反应的话， 我们是不是可以将细胞破碎，与抗体共孵育，然后离心，得到的抗体就是消除非特异性的抗体了？
3，目前， 阴性对照，只是用的没有感染病毒细胞做的，抗体和实验组是一样的。   结果也是跟实验组一样，红成一片
赞一下(1人) 回复此楼
每一天都是一个新的起点
6楼2011-02-15 17:17:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dianaofyezi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2): 热心 2011-02-16 10:39:14
引用回帖:
Originally posted by 未知树 at 2011-02-15 17:17:43:


1，抗体没有纯化，直接取的兔血清。
2，细胞中如果有其他蛋白与其有交叉反应的话， 我们是不是可以将细胞破碎，与抗体共孵育，然后离心，得到的抗体就是消除非特异性的抗体了？
3，目前， 阴性对照，只是用 ...

根据你的情况，我还是建议你将血清纯化之后再做，不管怎么说没有感染病毒的细胞又有反应，这说明血清中的其他成分和细胞中中的某些抗原结合了。一般来说对照里面会有一个同型血清的对照，你试试看吧。
赞一下(2人) 回复此楼
52187644
7楼2011-02-16 08:51:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

阿娇阿娇

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主你好，我最近也要做多抗，是MBP-NAP融合蛋白，想来制备NAP的多抗。

你当初用X-MBP（带有MBP标签的融合蛋白）去免疫，是为了得到X的多抗吗？是把X偶联制作亲和层析介质，进行亲和纯化的吗？谢谢解答
赞一下 回复此楼
8楼2012-03-22 14:12:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

未知树

木虫 (著名写手)
引用回帖:
1603498楼: Originally posted by 阿娇阿娇 at 2012-03-22 14:12:26:
楼主你好，我最近也要做多抗，是MBP-NAP融合蛋白，想来制备NAP的多抗。

你当初用X-MBP（带有MBP标签的融合蛋白）去免疫，是为了得到X的多抗吗？是把X偶联制作亲和层析介质，进行亲和纯化的吗？谢谢解答

我们用的是invotrigen公司的MBP纯化系统， 所有步骤都是按照上面来的。
是制备多抗。
你看看他们公司的操作手册吧，上面还挺清楚的。
如果靶标蛋白太小， 必须要切除MBP的。 不然会影响抗体的效果。
赞一下 回复此楼
每一天都是一个新的起点
9楼2012-03-22 19:41:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

阿娇阿娇

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1603533楼: Originally posted by 未知树 at 2012-03-22 19:41:03:
我们用的是invotrigen公司的MBP纯化系统， 所有步骤都是按照上面来的。
是制备多抗。
你看看他们公司的操作手册吧，上面还挺清楚的。
如果靶标蛋白太小， 必须要切除MBP的。 不然会影响抗体的效果。

invotrigen公司的MBP纯化系统？我怎么找不到啊，是用来纯化MBP-X融合蛋白的吗？楼主的X是多大的蛋白，你直接用 MBP-X 去免疫的吗？
赞一下 回复此楼
10楼2012-03-23 11:38:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 未知树 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-29 10:18 by winsaint
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +13 晴天加油 2026-08-26 14/700 2026-08-28 18:36 by huagongfeihu
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +3 德尚中行 2026-08-27 3/150 2026-08-28 15:24 by rongshuxia
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +4 gdd2018 2026-08-28 9/450 2026-08-28 14:22 by jklily
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[职场人生] 学生撞见辅导员送外卖，第二天全班都沉默了 +3 鲸鱼融金_浙江_� 2026-08-22 3/150 2026-08-26 09:01 by zzuzxg
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭